聚氯乙烯(PVC)具有较好的生物相容性和良好的机械性能，在气管插管、导尿管、血液透析导管、外周静脉置入中心静脉导管等植入、介入医用导管领域具有广泛的应用[1]. 由于PVC本身是一种惰性材料，自身不具备抗菌性能，因此当细菌接触到PVC导管表面时，该医用导管表面无法抑制后续发生的细菌定植、繁殖等一系列过程，导致形成细菌生物被膜，从而引发感染. 目前，临床上针对植入、介入医用导管引发的细菌感染问题，通常采用抗生素进行治疗. 由于抗生素的广泛使用容易导致耐药菌的出现，因此在医用材料表面构建具有响应性或协同作用的抗菌涂层成为生物材料领域的研究热点[2~4]. 但是，医用导管表面一旦形成细菌生物被膜，将阻碍抗生素的渗透，使得清除生物被膜内部的细菌变得更加困难[5~9]. 一旦生物被膜解体后，单个浮游细菌就失去了生物被膜的保护，此时使用抗生素或结合其他抗菌策略，就可以有效清除细菌感染[10]. 因此，研究同时具有抗菌和抑制细菌生物被膜形成功能的生物材料对减少植入、介入医用导管引发的细菌感染具有重要意义[11~15].细菌生物被膜是一种由细菌分泌的多糖、蛋白质、脂质等胞外聚合物(EPS)包裹菌体形成的被膜状生物群体[16]. 细菌生物被膜在自然状态下会经历细菌定植、菌落形成、生物被膜成熟和生物被膜分散4个阶段[17]. 当细菌生物被膜中的营养物质被耗尽，或当生物被膜中的细菌变得过于拥挤，以及细菌处于不适宜的生存环境时，一些细菌会以分散的方式离开生物被膜，并寻找新的定植点. 细菌生物被膜的分散过程可以通过细菌感知D-氨基酸、顺式-2-癸烯酸、酰基高丝氨酸内酯、自诱导肽、一氧化氮等信号分子启动[18~21]. 例如：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生物被膜在达到成熟期后可以产生具有分解生物被膜能力的D-酪氨酸，并通过抑制胞外多糖的产生以及阻碍淀粉样纤维在细胞壁表面正确定位等机制引起生物被膜分散[18]. 受上述研究启发，本文工作旨在构建通过可逆共价键偶联的抗菌分子和细菌生物被膜分散信号分子抑制PVC医用导管表面细菌生物被膜的形成.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种用于研究细菌生物被膜形成的模式菌株，同时也是造成医用导管引发的相关医源性感染的主要病原菌[22~25]. 针对铜绿假单胞菌在PVC医用导管表面形成的生物被膜难以通过抗生素治疗清除的问题，在PVC医用导管表面通过醛化葡聚糖成功构建了酸敏感响应性高分子涂层(图1). 首先，通过(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)硅烷偶联剂在PVC片材表面进行氨基化修饰，并将修饰D-酪氨酸的醛化葡聚糖(ODex-y)通过希夫碱反应修饰在PVC片材表面. 之后通过ODex-y与多黏菌素B (PMB)之间的希夫碱反应在PVC片材表面构建多层交联高分子涂层. 该高分子涂层可以在pH=5.5的弱酸性细菌感染微环境中响应性释放具有诱骗细菌生物被膜解散功能的D-酪氨酸和具有杀菌功能的多黏菌素B，有效抑制PVC医用导管表面细菌生物被膜的形成，同时减少植入体周围细菌感染引发的组织炎症.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23160.F001Fig. 1Schematic illustration of the D-tyrosine (D-Tyr) and polymyxin B (PMB) modified polymer coatings on PVC surface.1实验部分1.1主要原料葡聚糖(MW 20 kDa)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、高碘酸钠、盐酸羟胺、乙二醇购于萨恩化学技术(上海)有限公司，硫酸多黏菌素B (PMB)购于梯希爱化学试剂公司(TCI)，D-酪氨酸(D-Tyr)购于Sigma-Aldrich，细菌死活染色试剂盒购于Thermo Fisher Scientific. 去离子水(18 MΩ·cm)通过Millipore超纯水系统获得.1.2醛化葡聚糖(ODex)的合成将葡聚糖(3.0 g，0.15 mmol)加入100 mL去离子水中，在50 ℃油浴中加热使葡聚糖完全溶解. 将葡聚糖溶液冷却至室温后，加入高碘酸钠(3.96 g，18.5 mmol)并在室温下避光搅拌反应24 h. 之后加入乙二醇(1.5 mL，26.9 mmol)并搅拌1 h后终止反应. 反应后的溶液在去离子水中透析(MWCO 3500 Da) 3天后，经冷冻干燥得到醛化葡聚糖(ODex).醛化葡聚糖(ODex)的醛化度采用盐酸羟胺滴定法进行测定. 具体实验步骤如下: 将0.1 g ODex溶解于25 mL去离子水中，待完全溶解后，加入0.5 g盐酸羟胺，并在室温条件下搅拌24 h. 反应结束后，用0.1 mol·L-1的NaOH溶液进行滴定，并在滴定过程中记录溶液的pH. 通过记录溶液pH发生最大突变(ΔpH/ΔV)时对应的NaOH溶液体积，可以通过公式(1)计算出ODex的醛化程度(葡聚糖链段中每100个葡萄糖单元中被氧化的葡萄糖单元的个数):Oxidation degree%=V0⋅M⋅Mw2×1000W×100% (1)其中，V0为pH发生最大突变(ΔpH/ΔV)时对应的NaOH溶液的体积(mL)，M为氢氧化钠溶液的摩尔浓度(mol·L-1)，Mw为葡聚糖链上每个葡萄糖单位的分子量(162.14)，W为ODex的质量(g).1.3D-酪氨酸修饰葡聚糖(ODex-y)的合成将D-Tyr (20 mg，0.11 mmol)溶解于40 mL PBS缓冲溶液(pH=8.0)中，再加入ODex (200 mg，0.01 mmol)，在室温下通过磁力搅拌反应12 h. 反应后的溶液在去离子水中透析(MWCO 3500 Da) 3天后，经冷冻干燥得到D-酪氨酸修饰葡聚糖(ODex-y). ODex-y中D-Tyr的修饰量通过紫外分光光度计(Shimadzu，UV-2600)进行表征. 首先，配制浓度分别为20，40，60，80，100 μg·mL-1的D-Tyr标准溶液，并分别测定上述D-Tyr溶液在278 nm的吸光度. 之后，配制浓度为250 μg·mL-1的ODex-y溶液和ODex溶液，并通过紫外分光光度计分别测定上述2种溶液在200~400 nm的吸光度曲线，并根据上述2种溶液在278 nm的吸光度值之差计算ODex-y分子链中每100个葡萄糖单元修饰D-Tyr的个数.1.4PVC片材表面高分子涂层的修饰首先，根据不同需要将PVC片剪裁成0.6 cm×0.6 cm或2.0 cm × 2.0 cm. 将PVC片在Decon 90水溶液中浸泡1 h后超声清洗15 min，之后在去离子水中超声清洗3次，每次15 min. 然后，将PVC片用氮气吹干并储存备用. 将清洗干净的PVC片用氧等离子体清洗机(90 W)处理3 min后，将PVC片浸泡于5 vol% APTES的乙醇水溶液中(乙醇与水的体积比为9/1)，并在60 ℃烘箱中静置5 h. 取出反应后的PVC片并分别在乙醇和去离子水中清洗15 min，将得到的PVC片用氮气吹干，并置于60 ℃烘箱中使表面的APTES硅烷偶联剂固化交联，得到氨基修饰的PVC片(PVC-NH2).将PVC-NH2片浸没于ODex-y浓度为10 mg·mL-1的PBS缓冲溶液(0.01 mol·L-1，pH=7.4)中，在37 ℃摇床中反应1 h后，后用去离子水清洗2 min并用氮气吹干，得到修饰有ODex-y的PVC片(PVC-Oy). 然后，将得到的PVC-Oy片浸没于PMB浓度为10 mg·mL-1的PBS缓冲溶液(0.01 mol·L-1，pH=7.4)中，在37 ℃摇床中反应1 h后，用去离子水清洗2 min并用氮气吹干，得到修饰有PMB的PVC片(PVC-OyP). 之后，重复上述步骤得到多层修饰的PVC片材(PVC-OyPn)，其中n表示ODex-y与PMB的层数. 在不包含D-Tyr的高分子涂层中，以ODex代替ODex-y与PMB通过希夫碱反应形成多层交联高分子涂层(PVC-OPn)，其中n表示ODex与PMB的层数.1.5高分子涂层修饰的PVC表面理化性质表征通过固体表面分析仪(SurpassTM 3，Anton Paar)对样品修饰过程中表面电位的变化进行表征; 通过原子力显微镜(Bruker，Dimension Icon)对修饰过程表面涂层厚度的变化进行表征；通过X射线光电子能谱(Bruker，Krotos AXIS His)对样品表面的元素组成和元素的化学价态进行表征.1.6高分子涂层中D-Tyr与PMB的pH响应性释放1.6.1D-Tyr的响应性释放将PVC-OyP5片材裁剪成2.0 cm × 2.0 cm大小后，分别浸没在2.0 mL PBS缓冲溶液(0.01 mol·L-1，pH=7.4)或MES缓冲溶液(pH=5.5)中. 之后，将装有PVC-OyP5片材和缓冲溶液的离心管置于摇床(37 ℃，100 r·min-1)中，每隔一段时间取出500 μL浸提液并补加相同体积的缓冲溶液. 采用高效液相色谱法(Shimadzu，LC-20AT)测定片材表面D-Tyr的释放曲线. 高效液相色谱实验中采用C18反式色谱柱，流动相为醋酸钠(0.1 mol·L-1，pH=4.0)/甲醇(体积比为90/10)，流速为1 mL·min-1. D-Tyr标准溶液的浓度分别为2，5，10，20，50 μg·mL-1.1.6.2PMB的响应性释放首先用异硫氰酸荧光素酯(FITC)对PMB分子进行荧光标记. 取200 mg PMB溶解于含有20%乙醇的PBS缓冲液中. 完全溶解后，加入14 mg FITC，避光搅拌12 h后，在去离子水中透析3天(MWCO 500 Da)，冷冻干燥后制得样品FITC-PMB. 荧光素与PMB分子的摩尔比(F/P)通过荧光光谱仪(Hitachi，F-7000)进行表征，其中FITC的标准溶液的浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.8，2.0 μg·mL-1，FITC-PMB的浓度为50 μg·mL-1. 之后，用FITC-PMB替换PMB对PVC片材表面进行功能化修饰，记为PVC-OyPF5. 将PVC-OyPF5裁剪成4 cm × 4 cm大小后，分别浸没在8 mL PBS缓冲溶液(0.01 mol·L-1，pH=7.4)或MES缓冲溶液(pH=5.5)中. 之后，将装有PVC-OyPF5片材和缓冲溶液的离心管置于摇床(37 ℃，100 r·min-1)中，每隔一段时间取出2 mL浸提液并补加相同体积的缓冲溶液. 将取出的pH=5.5的浸提液用0.5 mol·L-1的NaOH溶液调节pH至7.4，并通过荧光光谱仪测定FITC-PMB的释放曲线.1.7多黏菌素B(PMB)的抗菌性能表征多黏菌素B(PMB)对革兰氏阳性菌Bacillus subtilis (B. subtilis，ATCC 29056)、Staphylococcus aureus (S. aureus，CMCC(B) 26003)和革兰氏阴性菌Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa，ATCC 27853)、Escherichia coli (E. coli，ATCC 25922) 4种模式菌株的最低抑菌浓度(MIC)通过微量2倍稀释法进行表征. 将80 μL含有2×105 CFU·mL-1细菌的LB培养基与80 μL含有不同浓度(2倍连续稀释) PMB的LB培养基混合均匀并在细菌培养箱中孵育12 h (37 ℃，150 r·min-1)，之后用酶标仪(Cytation，Biotek)读取96孔板在600 nm处的光密度(OD600). 多黏菌素B对上述4种菌株的抑菌率通过公式(2)计算获得:Inhibitory ratio%=ODcontrol-ODsampleODcontrol-OD0×100% (2)其中，ODcontrol为菌液与LB培养基混合后的光密度平均值，ODsample为菌液与含有不同浓度PMB培养基混合后的光密度平均值，OD0为空白LB培养基光密度平均值.1.8高分子涂层修饰PVC表面的抗菌性能表征高分子涂层修饰的PVC表面抗菌性能分别采用细菌死活染色和贴膜法进行表征. 在细菌死活染色实验中，先将PVC、PVC-OyP1、PVC-OyP3和PVC-OyP5 4组样品裁剪成0.6 cm × 0.6 cm大小，用75%酒精浸泡并干燥后放入48孔板中，之后每个孔中加入600 μL含有5×106 CFU·mL-1 P. aeruginosa的PBS (0.01 mol·L-1，pH=7.4)或MES (pH=5.5)缓冲溶液，放入摇床孵育24 h(37 ℃，150 r·min-1). 孵育结束后，将片材取出，用PBS缓冲溶液轻轻地清洗片材表面，并在避光条件下分别用SYTO 9绿色荧光核酸染料(6 μmol·L-1)和碘化丙啶(PI，6 μmol·L-1)染色10 min，并通过激光共聚焦显微镜(CLSM，Leica，SP8)观察片材表面细菌的死活状态.高分子涂层修饰PVC表面的抗菌性能的贴膜法表征参照GB/T 31402-2015执行，具体的实验步骤如下: 将PVC、PVC-OyP1、PVC-OyP3和PVC-OyP5 4组样品裁剪成2.0 cm × 2.0 cm大小，用75%酒精浸泡并干燥后放入6孔板中. 取30 μL含有1×105 CFU·mL-1 P. aeruginosa的LB培养基滴加到每个待测片材表面，并将与PVC片材相同尺寸的无菌盖玻片覆盖于接种好的菌液上，并向下轻轻按压盖玻片使菌液向四周扩散，并确保菌液不要从片材边缘溢出. 在待测片材表面接种完菌液并覆盖上盖玻片后，盖上孔板盖，在相对湿度不小于90%的条件下放入恒温细菌培养箱中孵育24 h (37 ℃). 孵育结束后，用4 mL PBS缓冲溶液(pH=7.4)冲洗待测片材表面的细菌，并将冲洗液稀释200倍后接种于LB琼脂平板，在37 ℃细菌培养箱中孵育16 h后对LB琼脂平板上的细菌菌落进行计数统计.1.9高分子涂层修饰PVC表面的抗细菌生物被膜性能表征分别通过激光共聚焦显微镜(Leica，SP8)和结晶紫染色法对PVC-OyP5和PVC-OP5抑制生物被膜的性能进行表征，并使用未修饰的PVC材料作为实验的对照组. 在激光共聚焦显微镜表征中，先将PVC、PVC-OP5和PVC-OyP5 3种片材裁剪成0.6 cm × 0.6 cm大小，或将PVC医用气管插管切成1 cm长段，并用上述相同的方法进行功能化修饰. 用75%酒精浸泡并干燥后放入48孔板中，之后将600 μL含有1×107 CFU·mL-1 P. aeruginosa和5%葡萄糖的LB培养基加入放置片材的孔中，并在37 ℃恒温细菌培养箱中孵育3天. 孵育结束后将片材取出，按照1.8节中所述方法对片材表面细菌生物被膜进行死活染色，并用激光共聚焦显微镜对细菌生物被膜的3D结构进行成像. 在结晶紫染色实验中，首先通过上述方法分别在PVC、PVC-OP5和PVC-OyP5 3种片材表面培养P. aeruginosa生物被膜. 培养结束后，将片材取出并用PBS缓冲溶液轻轻地清洗片材表面后，将片材放置于50 ℃恒温烘箱中干燥3 h，用以固定表面生物被膜. 之后，将上述片材放入48孔板中，并以未进行生物被膜培养的PVC片材作为阴性参照. 将600 μL含有0.5%结晶紫的生理盐水溶液加入孔板中，在室温条件下静置20 min对细菌生物被膜进行染色. 染色结束后，将片材取出并用PBS缓冲溶液冲洗3次. 之后，将清洗后的片材放入48孔板中，每孔加入600 μL乙醇，超声清洗1 min溶解片材上的结晶紫. 超声结束后将片材取出，并用酶标仪测量洗脱液在590 nm处的吸光度，并按公式(3)计算不同片材上生物被膜相对量:Relative biofilm mass%=ODsampleODcontrol×100% (3)其中，ODcontrol为未修饰的PVC片材上细菌生物被膜经结晶紫染色后洗脱液的光密度平均值，ODsample为PVC-OP5或PVC-OyP5片材上细菌生物被膜经结晶紫染色后洗脱液的光密度平均值.1.10高分子涂层修饰PVC表面的溶血测试取1 mL大鼠全血加到20 mL生理盐水中，离心(2200 r·min-1) 10 min后将上清液吸出，重复上述操作两次，将得到的下层红细胞在生理盐水中重悬后制备得到4%的大鼠红细胞悬浮液(rRBCs). 分别将PVC和PVC-OyP5片材置于48孔板中，之后分别向每孔加入500 μL rRBCs悬浮液和500 μL生理盐水. 阳性对照组中加入500 μL rRBCs悬浮液和500 μL细胞裂解液(Triton X-100)，阴性对照组中加入500 μL rRBCs悬浮液和500 μL生理盐水. 将孔板置于37 ℃培养箱内孵育1 h后，取出孔中悬浮液离心10 min (2000 r·min-1)，取上清液加入96孔板中并用酶标仪测量545 nm处的光密度(OD545)，并按公式(4)计算PVC和PVC-OyP5片材的溶血率:Hemolysis%=ODsample-ODnegativeODpositive-ODnegative×100% (4)其中，ODpositive为阳性对照组的光密度平均值，ODnegative为阴性对照组的光密度平均值，ODsample为与PVC或PVC-OyP5片材共同孵育1 h后样品组的光密度平均值.1.11高分子涂层修饰PVC表面的细胞毒性测试细胞毒性实验中使用小鼠成纤维细胞(L929)，采用MTT法进行测试. 将PVC和PVC-OyP5片材用75%乙醇灭菌后，分别在pH=7.4以及pH=5.5的RPMI1640培养基中浸提24 h，之后将pH=5.5的浸提液用0.1 mol·L-1的NaOH溶液调节至pH=7.4. 将L929细胞(104个)接种于96孔板，在含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和1%链霉素的RPMI1640培养基中进行培养24 h(37 ℃，5% CO2)后，将原培养基吸出，并加入60 μL浸提液和60 μL RPMI1640培养基，继续培养24 h (37 ℃，5% CO2). 之后，将培养基吸出，加入80 μL MTT溶液(0.5 mg·mL-1)，在37 ℃下避光孵育4 h. 随后将孔板中的MTT溶液吸出，加入80 μL 二甲基亚砜(DMSO)后轻轻晃动以溶解活细胞代谢性还原MTT产生的蓝紫色结晶甲臜，并用酶标仪测量该溶液在560 nm处的光密度(OD560)，按公式(5)计算PVC和PVC-OyP5片材浸提液的相对细胞存活率:Relative cell viability%=ODsampleODcontrol×100% (5)其中，ODcontrol为用RPMI1640培养基替代浸提液的对照组的光密度平均值，ODsample为加入浸提液实验组的光密度平均值.1.12高分子涂层修饰PVC表面的体内抗菌实验所有动物实验均经中国医学科学院(CAMS)和北京协和医学院伦理委员会批准，并符合中华人民共和国卫生部《动物管理条例》. 选用6周雌性BALB/C小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)进行体内抗菌实验. 将实验小鼠(n=3)用异氟烷麻醉，对其背部进行脱毛后在小鼠脊柱两侧进行切口，并分离皮肤和肌肉便于片材埋入. 分别将10 μL P. aeruginosa菌液(1010 CFU·mL-1)滴加到PVC或PVC-OyP5片材表面，实验小鼠左侧植入PVC片材，右侧植入PVC-OyP5片材. 完成皮下埋植后对切口进行缝合处理. 埋植一天后将片材取出，用PBS轻轻地清洗片材，并在避光条件下用SYTO 9和PI染色10 min，通过激光共聚焦显微镜观察片材表面生物被膜的生长情况. 将与埋植片材接触的皮下组织进行病理切片，并使用苏木精&伊红(H&E)进行染色. 将埋植片材周围组织进行匀浆处理，取30 μL稀释后的匀浆液接种于LB琼脂平板，在37 ℃细菌培养箱中孵育16 h后对LB琼脂平板上的细菌菌落进行计数统计.1.13统计分析论文数据图中的数据为至少3组平行样本的平均值，数据图中的误差棒为平行样本的标准差. 采用单向方差分析(ANOVA)和Bonferroni校正检验对实验数据进行统计学分析(***p0.001).2结果与讨论2.1ODex-y的合成与多层交联高分子涂层的构建通过NaIO4氧化法合成了醛化葡聚糖(ODex)，并通过盐酸羟胺滴定法对ODex的醛化度(葡聚糖链段中每100个葡萄糖单元中被氧化的葡萄糖单元的个数)进行测定. 盐酸羟胺滴定过程中溶液的pH变化及其微分曲线如图2(a)和2(b)所示. 当加入NaOH溶液的体积为10.6 mL时，溶液pH出现最大变化值. 将V0=10.6代入公式(1)，可得ODex的醛化度Oxidation degree=85.9%. 图2(c)和2(d)分别是不同浓度的D-Tyr在278 nm的标准吸收曲线以及浓度均为250 μg·mL-1的ODex、ODex-y的UV吸收光谱. 从图2(d)可知，修饰了D-Tyr的ODex-y在278 nm处的吸光度为0.747，而未修饰D-Tyr的ODex在278 nm处的吸光度为0.066，可以认为二者吸光度之差(ΔA=0.681)是由于ODex上修饰了D-Tyr分子产生的. 根据图2(c)中D-Tyr吸光度的线性拟合方程，可以计算得到ODex-y中修饰D-Tyr的浓度为84.73 μg·mL-1 (4.68×10-4 mol·L-1)，250 μg·mL-1的ODex中葡萄糖单元的浓度为1.542×10-3 mol·L-1，因此ODex-y中D-Tyr的修饰程度约为30.4%，即葡聚糖链段中每100个葡萄糖单元中修饰30.4个D-Tyr分子.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23160.F002Fig. 2(a) The pH variation curve and (b) derivatives of hydroxylamine hydrochloride titration for ODex. (c) Calibration curve of D-Tyr. (d) UV absorbance spectra of ODex and ODex-y, respectively.通过希夫碱反应利用ODex-y和PMB在PVC片材和导管表面构建多层交联高分子涂层. 图3(a)是在PVC片材表面修饰多层交联高分子涂层过程中表面Zeta电位的变化. 根据电位变化可以看出，当PVC修饰APTES之后，表面电位从0.7 mV升高至42.6 mV，产生这一现象的原因是由于PVC表面修饰的氨基由于质子化效应导致表面正电荷数量增大. 当修饰ODex-y后，由于ODex-y的负电荷基团可以部分中和或屏蔽表面氨基的正电荷，使材料的表面电位下降至11.3 mV. 修饰PMB后，由于PMB分子中包含未反应的氨基，使材料的表面电位再次升高至35.8 mV. 后续的多层修饰后材料的表面电位表现出类似的交替变化趋势，表明聚合物涂层成功的修饰在了PVC基体表面.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23160.F003Fig. 3Characterization of the multilayered D-tyrosine modified polymer coatings. (a) Changes in Zeta potential of modified PVC surfaces. Oy denotes the modification of ODex-y,and P denotes the modification of PMB. (b) The representative AFM images (top) and the height profiles (bottom) of the multilayered polymer coatings on the surface of the PVC film.图3(b)是PVC材料表面ODex-y与PMB的层数分别为2、5、8时高分子涂层的原子力显微镜(AFM)图像. 为了对聚合物涂层的厚度进行表征，在修饰前将方形PDMS贴附于片材表面，修饰结束后将PDMS取下，用AFM在聚合物涂层的边缘进行涂层厚度分析. 这一结果表明聚合物涂层被成功修饰在PVC基材表面，并且随着修饰层数增加，聚合物的厚度也逐渐从100 nm增加到500 nm.图4是PVC与PVC-OyP5的X射线光电子能谱(XPS)谱图. 与PVC相比，PVC-OyP5表面在198.5 eV处Cl2p的峰消失，并在399 eV处出现N1s峰. 同时，N1s的精细扫描结果表明PVC-OyP5样品的N1s价态谱根据键能分为399.9和401.6 eV 2个峰，分别代表N＝C和N－C 2种化学键. 根据两峰面积比，可以计算涂层表面N元素形成亚胺的组分约为64%. 因此，通过XPS分析可知高分子涂层主要通过亚胺键修饰到PVC片材表面.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23160.F004Fig. 4XPS spectra of (a) PVC and (b) PVC-OyP5. Core-level spectra of N1s of (a') PVC and (b') PVC-OyP5.图5是PVC-OyP5或PVC-OyPF5高分子涂层中D-Tyr与PMB的pH敏感响应性释放曲线. 由于高分子涂层中的D-Tyr与PMB都是通过pH敏感的希夫碱键进行偶联，因此D-Tyr与PMB在弱酸性(pH=5.5)条件下可以产生响应性释放. 在正常生理条件下(pH=7.4)，D-Tyr和PMB在PBS缓冲溶液中的累计释放量均小于4.0 μg·cm-2，表明该高分子涂层具有较好的稳定性. 在弱酸性条件下(pH=5.5)，高分子涂层中的D-Tyr和PMB均可以响应性释放，起到抗菌和抑制细菌生物被膜10.11777/j.issn1000-3304.2023.23160.F005Fig. 5pH-responsive release of (a) D-Tyr and (b) PMB from PVC-OyP5 and PVC-OyPF5, respectively.形成的功能.2.2多层交联高分子涂层的抗菌性能PVC-OyPn多层交联高分子涂层中的PMB具有杀菌功能. 图6是不同浓度的PMB对B. subtilis、S. aureus、P. aeruginosa、E. coli 4种菌株抑菌率的柱状图. 图6(a)和6(b)表明PMB对B. subtilis和S. aureus的抗菌性能较差，直到256 μg·mL-1依然没有达到MIC值. 图6(c)和6(d)表明PMB对P. aeruginosa和E. coli的MIC分别为2和1 μg·mL-1.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23160.F006Fig. 6Inhibitory ratio of PMB against (a) B. subtilis, (b) S. aureus, (c) P. aeruginosa, and (d) E. coli, respectively, at a variety of concentrations.这一结果表明，PMB主要对革兰氏阴性菌具有较好的抗菌功能. 这是由于PMB的主要作用靶点是革兰氏阴性菌的外膜，PMB分子结构中带正电荷的α, γ-二氨基丁酸基团与细菌外膜结构中带负电荷的磷脂基团发生静电相互作用，从而取代细菌外膜结构中的Ca2+和Mg2+，降低细菌外膜的结构稳定性从而导致细菌死亡[26]. 另一方面，由于革兰氏阳性菌最外层是肽聚糖结构，缺少PMB的作用靶点，因此PMB对革兰氏阳性菌的抗菌作用较弱[27]. 由于P. aeruginosa是一种革兰氏阴性菌，同时也是气管插管相关感染中常见的致病菌之一，对PMB较为敏感，且其生物被膜的分散过程受D-Tyr调控，因此本文中以P. aeruginosa作为医用导管引发细菌感染的模式菌株对多层交联高分子涂层的抗菌性能进行研究.为筛选合适的交联高分子涂层，分别对PVC、PVC-OyP1、PVC-OyP3、PVC-OyP5 4种片材的抗菌性能进行表征. 图7(a)是P. aeruginosa经上述四种片材处理后进行死活染色的激光共聚焦显微镜图像. 在pH=7.4的缓冲液中，随着高分子涂层层数的增加，并没有显示出明显的抗菌效果. 在pH=5.5的缓冲液中，随着涂层数的增加，PVC-OyP5片材表现出较好的抗菌效果. 产生这一现象的可能原因是该高分子涂层通过pH敏感的希夫碱键交联形成，在弱酸性条件下希夫碱键水解释放出具有杀菌功能的PMB.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23160.F007Fig. 7(a) CLSM images of P. aeruginosa after being treated with PVC, PVC-OyP1, PVC-OyP3, and PVC-OyP5, respectively. The green fluorescence is stained with SYTO 9 to label live bacteria, and red fluorescence is stained with propidium iodide to label dead bacteria. (b) Photographs of P. aeruginosa cultures after being treated with PVC, PVC-OyP1, PVC-OyP3, and PVC-OyP5, respectively.为了进一步研究该高分子涂层是否具有自适应抗菌的功能，将P. aeruginosa用LB培养液稀释并分别滴加到PVC、PVC-OyP1、PVC-OyP3、PVC-OyP5 4种片材表面，并采用贴膜法对片材表面的抗菌性进行了表征. 图7(b)表明，在P. aeruginosa感染造成的弱酸性微环境中，PVC-OyP5表现出最好的pH响应性自适应抗菌效果.为了进一步研究多层交联高分子涂层抗细菌生物被膜的功能，分别将PVC、PVC-OP5、PVC-OyP5 3种片材浸没在P. aeruginosa培养基中进行孵育. 图8(a)表明，孵育3天后PVC片材表面形成了完整的P. aeruginosa生物被膜，并且通过细菌的死活染色未观察到生物被膜中的死菌. 未加入D-Tyr的高分子涂层PVC-OP5表面虽然有一部分死菌，但是仍然有较多生物被膜生长在表面，表明在高分子涂层中单独加入PMB后表面抗菌的作用非常有限. 而同时负载D-Tyr和PMB的PVC-OyP5片材则较好地抑制了表面P. aeruginosa生物被膜的形成. 对上述片材表面的细菌生物被膜进行结晶紫染色的结果如图8(b)和8(c)所示. 结晶紫染色的结果表明，PVC、PVC-OP5片材(左)及导管(右)表面都形成了均匀的细菌生物被膜，而PVC-OyP5片材(左)及导管(右)表面形成的生物被膜仅为PVC片材表面形成生物被膜的7.2%.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23160.F008Fig. 8(a) CLSM images of P. aeruginosa biofilm on the substrate of PVC, PVC-OP5, and PVC-OyP5, respectively. (b) Photographs of crystal violet stained P. aeruginosa biofilm on the substrate of PVC, PVC-OP5, PVC-OyP5, and pristine PVC (without biofilm culturing), respectively. (c) Relative biofilm mass on the substrate of PVC, PVC-OP5, and PVC-OyP5, respectively (n=3, ***p0.001).2.3多层交联高分子涂层的细胞毒性和溶血性根据表面的细胞毒性和溶血测试对多层交联高分子涂层的生物安全性进行初步评估. 图9(a)表明，在正常生理条件下(pH=7.4)浸提1天后，PVC和PVC-OyP5片材的浸提液对小鼠成纤维细胞(L929)均没有明显的细胞毒性，表明多层交联高分子涂层中的PMB处于安全释放范围. 在弱酸性条件下(pH=5.5)浸提1天后，PVC片材的浸提液对L929细胞没有明显的细胞毒性，而PVC-OyP5片材的浸提液导致L929细胞的活性明显降低，表明在弱酸性条件下多层交联高分子涂层中PMB的释放会造成细胞毒性. 在多层交联高分子涂层的溶血性方面，分别使用Triton X-100和生理盐水作为阳性和阴性对照，对PVC和PVC-OyP5的溶血性进行表征. 图9(b)表明，PVC和PVC-OyP5的溶血率无显著性差异，且均小于5%，满足医用导管对溶血率的要求.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23160.F009Fig. 9(a) Relative cell viability of PVC and PVC-OyP5 at pH=7.4 and pH=5.5, respectively. (b) Hemolysis of PVC and PVC-OyP5 toward rRBCs.2.4多层交联高分子涂层的体内抗菌性能通过感染动物模型对多层交联高分子涂层的体内抗菌性能进行了研究. 在动物感染模型的建立中，将108 CFU P. aeruginosa分别接种到PVC和PVC-OyP5片材表面，并分别埋植到小鼠脊柱两侧皮下，如图10(a)所示. 埋植1天后取出PVC和PVC-OyP5片材，经SYTO 9和PI染色后通过激光共聚焦显微镜研究片材表面细菌生物被膜的状态. 图10(b)表明，在感染动物模型中PVC片材表面形成了大量细菌生物被膜，而PVC-OyP5片材表面则表现出了良好抑制生物被膜生成的效果. 图10(c)表明在感染动物模型中PVC-OyP5植入体片材周围组织中的细菌数量明显少于PVC周围组织中的细菌数量. 上述结果表明多层交联高分子涂层在动物体内仍然具有优异的抗菌与抑制细菌生物被膜形成的功能.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23160.F010Fig. 10(a) Photograph of BALB/C mouse for in vivo antibacterial assessment of PVC and PVC-OyP5. (b) CLSM images of P. aeruginosa biofilm on the substrate of PVC (top) and PVC-OyP5 (bottom), respectively, for in vivo antibacterial assessment. (c) Photographs of P. aeruginosa cultures harvested from the P. aeruginosa infected tissues around the implanted PVC (top) and PVC-OyP5 (bottom), respectively.取小鼠皮下植入体周围组织进行病理切片，并通过H&E染色研究细菌感染造成的炎症反应. 图11(a)表明，在PVC植入体周围组织中出现了大量中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞的浸润，说明植入体引发的细菌感染在周围组织中造成了严重的炎症反应. 与PVC相比，PVC-OyP5植入体周围组织中炎症细胞数量较少，表明PVC-OyP5的抗菌和抑制生物被膜形成的功能能够明显减轻植入体周围组织的炎症反应，如图11(b)所示.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23160.F011Fig. 11H&E staining of tissues around the (a) unmodified PVC and (b) PVC-OyP5. The zoom-in histological analyses in the dashed box are shown below.3结论通过酸敏感动态共价键在PVC表面构建了多层交联高分子涂层，通过响应性释放具有杀菌功能的PMB和抑制细菌生物被膜形成功能的D-Tyr，有效抑制PVC表面细菌生物被膜的形成，并减少细菌感染引发的组织炎症，在构建抗细菌生物被膜植入、介入医用导管领域具有广阔的研究和应用前景.