尽管近年来癌症的诊断和治疗已取得了长足的进步，但癌症仍是威胁公众健康的主要因素之一. 据统计，2020年全球新增癌症病例和死亡人数分别达到1930万和1000万人，且呈逐年增多的趋势[1]. 目前癌症的治疗方法主要包括手术治疗、化学药物治疗、放射治疗、免疫治疗、光动力治疗和超声治疗等[2~4]. 这些治疗方法均存在一定的局限性：化学药物治疗存在肿瘤靶向性差、组织渗透性低等缺点，且容易产生耐药性[5]；光学相关治疗方法存在组织穿透深度有限，难以对深层肿瘤起效的缺点[6]；免疫治疗存在响应率低等不足[7]. 为了克服这些局限性，多种新型的肿瘤治疗方法被相继开发. 其中，气体抗肿瘤疗法具有毒性小、不易产生耐药性、组织渗透性好、能够调控肿瘤组织微环境等优点，展现出广阔的应用前景[8,9].SO2是一种无色、透明和有刺激性气味的气体，通常被认为是一种对人类、动物和植物有害的大气污染物[10,11]. 近年来，越来越多的证据表明，SO2是正常生理过程中的一种信号分子，具有多种生物活性[12]. SO2可由细胞正常代谢产生，如含硫氨基酸的酶解产生，也可以通过在氧化应激下细胞中硫化氢的氧化产生[13]. 因此，SO2已被普遍认为是继一氧化氮、一氧化碳和硫化氢之后的第四种气体递质分子[14]. SO2易溶于水(25 ℃，9.4 g/100mL)，并可与水分子结合形成亚硫酸氢盐和亚硫酸盐[15]. SO2在哺乳动物体内受到严格的调控以维持体内平衡，在人体血清中的总亚硫酸盐浓度为0~10 μmol/L[16]. 在生理pH下，亚硫酸氢盐和亚硫酸盐的摩尔比约为1:3[17]. 同时，亚硫酸氢盐还可能二聚形成二亚硫酸盐(图1).10.11777/j.issn1000-3304.2023.23169.F001Fig. 1Interconversion of SO2 derivatives in aqueous solution.SO2的生理作用主要包括调节血管张力和钙离子通道，影响心脏功能及脂质代谢等，而病理生理作用则主要与其氧化作用、诱发炎症及促进细胞凋亡有关[18~20]. SO2及其水溶液中的衍生物能够对DNA造成损伤，包括碱基突变、双螺旋解旋和染色体断裂等损伤[21,22]. 同时，SO2能够扰乱细胞内氧化还原平衡，抑制细胞内抗氧化系统的功能，如降低谷胱甘肽含量及抗氧化酶的活性等[23]. SO2能够引发线粒体功能障碍、使得细胞内产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，并进一步引发细胞凋亡[24,25]. 研究表明，亚硫酸氢盐处理细胞后，会引起线粒体膜电位降低，细胞内腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)含量降低、ROS含量增加、凋亡相关蛋白的表达和活化，最终导致细胞凋亡[26,27]. 除此之外，SO2还会引起细胞和组织的脂质过氧化[28]，改变细胞膜的物理性质，并可能引起蛋白质和核酸的共价修饰，导致细胞死亡[29]. 总而言之，细胞内过量的SO2能够引发细胞氧化还原失衡，造成细胞凋亡. 这既是SO2毒性的来源之一，也为其杀伤肿瘤细胞，用于肿瘤气体治疗带来了契机.1可控释放SO2的小分子供体受限于SO2的刺激性气味，SO2治疗无法直接用于临床吸入式全身给药. 因此，亚硫酸盐混合溶液(通常HSO3-和SO32-的摩尔比为1:3)是目前主要的SO2供体. 但是，使用混合亚硫酸盐作为SO2供体时，可能会导致SO2的突释，且无机盐的肾脏清除率较高，极易被机体排出体外，同样难以获得实际应用[30]. 有研究通过调节机体代谢通路以增加内源性SO2的生成[31,32]，但该方法操作复杂、成本较高且难以用于SO2作用机制研究. 为了克服上述困难，化学家们开发出一系列能够可控释放SO2的有机小分子化合物，并开展了一系列机理和应用研究.1.1硫醇触发释放SO2的小分子供体谷胱甘肽(glutathione, GSH)等生物硫醇在生物体中普遍存在，在维持细胞氧化还原平衡、保持正常免疫功能、抗氧化和解毒等生物过程中发挥着重要作用[33]. 因此，将GSH等生物硫醇作为响应性刺激分子构建响应性SO2前体药物或生物医用材料，已被广泛应用于抗菌和抗肿瘤治疗[34,35]. Chakrapani课题组首先开发了一系列2,4-二硝基苯磺酰胺类(2,4-dinitrobenzenesulfonamides，DNs)化合物用作SO2供体(化合物1~11，图2(a))[36]. DNs能够与硫醇相互作用，通过Jackson-Meisenheimer复合物中间体释放SO2，相关的反应机理如图2(b)所示[30]. 研究结果显示，化合物能够在30 min内释放55%~100%的SO2 (化合物11为24%)，其中化合物6和7能够100%释放SO2. 为了更好地探明该类化合物的结构与SO2生成速率的关系，该课题组又合成了一系列具有不同氨基取代的化合物，表明该类化合物SO2的生成速率与供体的pKaH有一定的相关性，pKaH值越大，在生理条件(pH=7.4)下SO2的生成速率和效率就越高[37]. 在后续研究中，该课题组又合成了38个基于2,4-二硝基苯磺酰胺结构的SO2供体化合物库(包括12个“二聚体”)，并对相关化合物的SO2生成能力和抗耐药细菌的性能进行了研究[38]. 该研究发现，在SO2供体分子中引入炔丙基后，能够显著增强SO2供体的细菌杀伤能力. 筛选出的化合物12 (图2(c))对大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均表现出良好的抗菌效果. 上述效果可能来源于化合物12具有良好的细胞膜穿透能力以及有效消耗细胞内GSH的能力.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23169.F002Fig. 2The thiol-activated SO2-releasing donors and its proposed generation mechanism.1.2水解触发释放SO2的小分子供体除了硫醇响应的SO2小分子供体外，Chakrapani课题组还开发了系列水解触发释放SO2的化合物[39]. Benzosultine能够通过热逆Diels-Alder反应生成SO2，但反应需要较高的温度. 该研究通过计算Benzosultine、1-甲基-Benzosultine和1-苯基-Benzosultine生成SO2的反应能、吉布斯自由能和吉布斯自由能垒，证明苯取代能够降低反应能垒，加快反应速度并降低反应温度. 在此基础上，发展出一系列不同苯衍生物的SO2供体分子 (化合物13~20，图3(a))，这些化合物在37 ℃的PBS(pH=7.4)溶液中，SO2半数生成期为10~68 min，生成率为59%~89%，证明其在生理条件下能够成功释放SO2. Xian课题组在前期工作的基础上[40]，开发出一种水溶性的苯并噻唑硫酸钠化合物(化合物21，图3(b))[41]. 该化合物能够在水溶液中以pH依赖的方式分解并释放SO2，在pH=4、5、6、7.4的磷酸盐缓冲液中，SO2半数生成期分别为7.5 min、75 min、12.5 h和13天. 目前研究证明很多疾病，如肿瘤、炎症和细菌感染等具有酸性的病理微环境，该化合物的酸性pH响应性释放性能将使其有望在这些疾病的SO2气体治疗中发挥重要的作用.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23169.F003Fig. 3The hydrolysis-induced SO2-releasing donors.1.3酯酶触发释放SO2的小分子供体相比于硫醇触发释放SO2的小分子供体，酶触发的方式具有更高的选择性. Wang课题组于2017年开发了酯酶触发释放SO2的供体，其灵感来自朱利亚烯烃合成中会生成SO2副产物[42]. 化合物22~25在生理条件下经酯酶水解后，生成的醇代谢产物能够经过加成—消除反应形成亚磺酸中间体，然后释放SO2 (图4(a)). 化合物释放SO2的速率可通过修饰羧基端进行调节：化合物23和25的释放速率最快，SO2半数生成期分别为10和9 min；化合物22能够在2 h释放70%的SO2；化合物24的释放速率最慢，2 h后仅释放了10%. 次年，Chakrapani课题组也合成了基于苯磺酸衍生物的酯酶触发释放SO2体系(化合物26~33，图4(b))，其设计思路来自碳酸酯化合物被酯酶水解生成CO2[43]. 在该设计中，酯酶敏感部分(环丙甲酸酯)通过酯键连接到苯磺酸衍生物上. 酯酶水解后，中间产物的C－S键将发生断裂，生成SO2. 其中，化合物26在37 ℃的PBS溶液(pH=7.4) 中与酯酶共孵育，SO2半数生成期为4 min，最终生成率为80%.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23169.F004Fig. 4Esterase-sensitive SO2-releasing donors.1.4光触发释放SO2的小分子供体设计响应于外源性刺激的SO2小分子供体，有望进一步增加SO2释放的时空可控性. Chakrapani课题组于2015年开发了紫外光触发释放SO2的苯甲砜类化合物[44]. 在该研究中，作者共合成了17种不同取代基的化合物34~50 (图5(a))，多数化合物均表现出优良的SO2生成性能，相关的SO2释放机理如图5(b)所示. 在450 W的紫外灯照射10 min后，SO2的生成率为49%~90% (化合物35为30%，化合物36为12%)；照射60 min后，SO2的生成率为93%~100% (化合物35为75%，化合物36为43%). 同年，Uchida课题组也报道了一种可由紫外光触发释放SO2的二噻吩乙烯化合物[45]. 化合物51在紫外光和可见光的交替照射下，会发生可逆的环化和开环反应(图5(c)). 闭环异构体51c具有良好的稳定性，不会在加热或光照条件下降解生成SO2，而开环化合物51o则会在加热或紫外光照射的条件下产生SO2. 因此，51c化合物可用于储藏SO2气体，并在紫外光的照射下释放SO2. 作者同时研究了该化合物释放SO2诱导细胞死亡的作用，结果表明其对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)和犬肾细胞(MDCK)均表现出良好的细胞杀伤作用. 但由于紫外光的波长较短，组织穿透能力差，且紫外光具有光毒性，限制了上述化合物的体内应用. Singh课题组开发了具有单光子和双光子响应的SO2供体化合物52 (图5(d))[46]，该化合物可在λ≥365 nm的汞灯以及λ=730 nm的脉冲激光照射下，发生光解生成SO2以及羟基化合物(活性药物或/和荧光探针). 该体系的建立，有效扩大了光触发型SO2供体化合物的应用范围.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23169.F005Fig. 5Light-sensitive SO2-releasing donors.2可控释放SO2的高分子纳米药物上述可控释放SO2的小分子供体虽然能够实现SO2在体外的可控释放，但也存在着溶解度差、毒性大、体内清除效率快和缺乏靶向性等缺点，限制了SO2气体治疗的发展和临床应用. 将SO2小分子供体与合适的高分子材料通过化学键合或物理担载的方式结合，能够获得具有更好靶向性、稳定性和药代动力学行为的可释放SO2高分子纳米药物，其药效和毒副作用也有望得到改善[47~49]. 同时，由于肿瘤细胞的代谢十分旺盛，导致肿瘤细胞内ROS和GSH的水平都远远高于正常细胞. 研究表明，肿瘤细胞中GSH的浓度比血液和正常组织中分别高出100~1000倍和100倍[50]. 因此，GSH在肿瘤治疗中是一个良好的靶向分子和响应刺激分子[51]. 据此，我们课题组在2018年通过在甲氧基聚乙二醇-b-聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯) (mPEG-PLG)嵌段共聚物侧基修饰SO2小分子供体分子DNs，率先合成了一种具有GSH响应性的可控释放SO2聚合物前药分子mPEG-PLG(DNs)，并将其用于肿瘤治疗(图6(a))[52]. 所得mPEG-PLG(DNs)具有两亲性结构，在水溶液中能够自组装成粒径为29 nm左右的纳米粒子NPs. 在还原性硫醇分子(如GSH、Cys等)的作用下，NPs能够快速释放SO2 (图6(b)). 当被肿瘤细胞摄取后，NPs能够在细胞内快速释放SO2 (图6(c))，进而扰乱细胞内的氧化还原平衡，使得细胞内ROS的浓度升高(图6(d))，实现对肿瘤细胞的有效杀伤. 在此基础上，我们还发现所制备的NPs能够通过消耗GSH，下调谷胱甘肽过氧化酶4 (glutathione peroxidase, GPX4)的表达，造成肿瘤细胞的脂质过氧化积累，破坏其氧化还原稳态，从而选择性诱导肿瘤细胞铁死亡[53]. 此外，mPEG-PLG(DNs)聚合物在巯基作用下响应性释放SO2的同时，会由两亲性的结构转变为完全亲水的聚合物，导致其组装结构解体. 为此，我们进一步将mPEG-PLG(DNs)用作纳米药物载体担载其他治疗性药物，实现SO2和其他药物的联合抗肿瘤治疗. 例如，mPEG-PLG(DNs)可以高效担载化疗药物阿霉素(doxorubicin, DOX)制备纳米药物NPs(DOX)，其载药效率高达97.3%. NPs(DOX)能够显著提高耐药细胞对DOX的敏感性，有效抑制耐药性肿瘤的生长(图6(e))[52]. 同时，mPEG-PLG(DNs)也可以高效担载光敏剂5-(4-氨基苄基)-10,15,20-三苯基卟啉，实现对肿瘤的SO2气体和光动力联合治疗[54].10.11777/j.issn1000-3304.2023.23169.F006Fig. 6(a) The schematic illustration of in vivo drug delivery of the NPs(DOX) and GSH-responsive intracellular release of DOX and SO2; (b) The in vitro release behavior of SO2 from NPs(DOX); (c) Confocal laser scanning microscope images showing ROS generation and DOX release in MCF-7 ADR cells; (d) The ROS level measurements in MCF-7 ADR cells after incubation with NPs for 12 h; (e) The anti-cancer efficacy of NPs(DOX) in a MCF-7 ADR tumor-bearing mouse model (Reprinted with permission from Ref.[52]; Copyright (2018) Elsevier B.V.). (f) The chemical structure of mPEG-b-P(PA-alt-GDNs). (g) The chemical structure of mPEG-g-Dex(DIBA); (h) The SO2 release behaviors after adding different concentrations of GSH; (i) The DOX release behaviors in the present of 0, 5, 10 mmol/L GSH at pH=6.5 or 7.4. (j) Cell viability of B16F10 cells incubated with PDDN, DOX, or PDDN-DOX for 72 h; (k) Changes in tumor volume in mice (Reprinted with permission from Ref.[56]; Copyright (2021) Elsevier B.V.).在上述研究基础上，我们课题组还开发了多种具有不同聚合物骨架结构的可释放SO2的高分子纳米药物. 例如：首先通过开环交替共聚合成了一种炔基功能化的两亲性嵌段聚酯材料mPEG-b-P(PA-alt-GPE)，随后通过点击化学键合含DNs小分子前药获得可释放SO2聚合物前药分子mPEG-b-P(PA-alt-GDNs) (图6(f)). 所得聚合物能够自组装形成85.4 nm粒径的纳米胶束，并高效担载化疗药物伊立替康. 载药纳米胶束在进入肿瘤细后能够在高浓度的GSH作用下快速释放SO2和伊立替康药物，显示出联合增强的肿瘤细胞杀伤效果[55]. 除合成高分子外，我们还开发了基于天然高分子——葡聚糖的可释放SO2聚合物前药分子mPEG-g-Dex(DIBA) (图6(g))[56]. 该聚合物担载DOX后，得到的纳米药物PDDN-DOX的粒径为51.2 nm，其中DOX的载药量和载药效率分别为3.8 wt%和47.2%. 同样地，PDDN-DOX也具有良好的GSH响应性SO2和药物释放能力——能够在2 h内释放80%的SO2，在36 h内释放93%的DOX (pH=6.5，10 mmol/L GSH) (图6(h)和6(i)). PDDN-DOX具有良好的抗肿瘤活性，其细胞杀伤能力要优于DOX (图6(j)). 体内抗肿瘤实验结果表明，PDDN-DOX能够有效控制肿瘤的生长(图6(k))，具有良好的临床应用前景.我们的工作发表后，其他课题组也相继在可控释放SO2高分子材料领域开展了相关研究. 例如，Li等[57]通过可逆加成-断裂链转移聚合制备侧基含有SO2供体DNs的两亲性聚合物(图7(a)). 所得聚合物能够自组装成粒径为216 nm的纳米胶束，可用于担载SN-38等疏水抗肿瘤药物，并在巯基化合物(如半胱氨酸和同型半胱氨酸等)的作用下，释放SN-38和SO2. Liu等[58]则发展了一种GSH响应主链可裂解(chain-shattering)的SO2高分子前药mPEG-P(HDI-DN) (图7(b)). 该聚合物可高效自组装成粒径为50~90 nm的纳米胶束，其临界胶束浓度为56.2 mg/L. 研究结果表明，mPEG-P(HDI-DN)制备的胶束能够响应GSH并在24 h内释放全部的SO2. 体外和体内的实验结果表明该胶束具有良好的肿瘤细胞杀伤效果.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23169.F007Fig. 7(a) The schematic illustration of the thiol-responsive mechanism PEG45-b-PDNPSEMA16. (b) The synthesis route of mPEG-P(HDI-DN).利用高分子载体对SO2小分子供体进行担载是制备可控释放SO2高分子纳米药物的另外一种有效策略. 而且，在这种情况下，如果将SO2小分子供体与活性药物分子结合制备双功能化的前药分子，则能够进一步实现SO2气体与活性药物的联合抗肿瘤治疗[59~61]. 基于这种设计理念，我们课题组将光动力抗肿瘤药物艾拉(5-aminolevulinic acid，ALA)与DNs键合制备“二合一”的小分子前药DOA，并将其包载于甲氧基聚乙二醇-b-聚赖氨酸(mPEG-b-PLL)嵌段共聚物中制成载药纳米颗粒P-DOA NPs (图8(a))[62]. 纳米颗粒的粒径约为109 nm (图8(b))，其载药量和载药效率分别为26.4 wt%和55.1%. P-DOA NPs能够被肿瘤细胞有效摄取，并在肿瘤细胞内高表达的GSH作用下快速释放ALA和SO2. ALA能够在肿瘤细胞内通过血红素合成途径生成原卟啉IX，并在超声作用下生成单线态氧杀灭肿瘤细胞[63,64]. 同时，DOA对GSH的清除和SO2的释放能够显著增强肿瘤细胞内的ROS水平(图8(c))，提升ALA的声动力治疗效果(ALA的IC50为2.74 μg/mL，P-DOA NPs的IC50为0.36 μg/mL). 在小鼠黑色素瘤(B16F10)和皮肤鳞状细胞癌(SCC)模型中，P-DOA NPs均表现出更强的声动力抗肿瘤治疗效果. 类似地，Sun等[65]将DNs与具有光热效应的光敏剂分子键合制备双功能化前药分子S-DYE，随后将其负载于含奥沙利铂结构单元的两亲性聚合物DHAA-PEG-Pt-PLGA中，制备出载药纳米胶束DPPtP/SD (图8(d)和8(e)). 在肿瘤细胞内高浓度GSH的作用下，载药纳米胶束快速释放SO2 (图8(f))并引起细胞内ROS水平升高(图8(g))，同时激活光敏剂分子，恢复其光热效应. 实验结果表明，释放SO2引起的氧化还原平衡变化能够与光敏剂分子的光热效应和奥沙利铂的化疗作用联合，实现协同增强的抗肿瘤治疗效果.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23169.F008Fig. 8(a) Schematic illustration of the preparation of P-DOA NPs for photoacoustic imaging-guided enhanced sonodynamic therapy against skin cancers; (b) Size of P-DOA NPs measured by dynamic light scattering; (c) Confocal laser scanning microscope images showing ROS generation in B16F10 cells (Reprinted with permission from Ref.[62]; Copyright (2022) Wiley-VCH). (d) Schematic illustration of the theranostics platform for colorectal peritoneal metastases for tumor tracking and photothermal-enhanced chemotherapy; (e) The chemical structure of DHAA-PEG-Pt-PLGA; (f) The SO2-releasing kinetics from DPPtP/SD upon being treated with GSH with different concentrations; (g) The ROS level of HCT-116 cells upon being treated with DPPtP/SD (Reprinted with permission from Ref.[65]; Copyright (2021) Wiley-VCH).3总结与展望当前，随着各种SO2小分子供体的相继开发，SO2的生物学效应及其在疾病治疗方面的应用潜力也被不断探索和开发. 这些供体具有不同的触发释放机制，如内源性刺激(pH、GSH、酯酶)和外源性刺激(光)等. 这些响应性触发释放机制能够使得SO2的体内递送具有更高的可控性和组织特异性，提高SO2向靶细胞/组织/器官的递送和释放效率，且能够针对不同部位和类型的癌症设计更加个性化的SO2气体治疗方案. 然而，目前的SO2小分子供体大多存在着水溶性差、体内清除过快等问题，极大地限制了其在体内的应用和临床转化.将SO2与高分子纳米载体技术相结合，开发出可释放SO2高分子纳米药物能够显著延长其体内循环时间，并通过被动或主动靶向在肿瘤部位聚集. 若再辅之以响应内源性或外源性刺激的可控释放手段，能够有效提高SO2气体在肿瘤组织/细胞内的浓度，改善SO2气体治疗的效果，同时还能够降低其毒副作用. 目前，可释放SO2高分子纳米药物的制备方法主要有2种：一是将SO2供体通过共价化学键连接在两亲性聚合物侧链上，再通过自组装成形成载药纳米粒子；二是通过非共价作用将SO2供体分子担载于聚合物纳米粒子内部，形成载药纳米粒子. 自2018年本课题组率先将可释放SO2高分子纳米药物用于抗肿瘤治疗后，SO2气体治疗肿瘤已有较大的发展，但也存在着诸多挑战. 首先，目前绝大多数的可控释放SO2高分子纳米药物采用GSH响应触发释放SO2气体的方式，开发对其他肿瘤微环境特征(如低pH、乏氧和高代谢活性)响应的SO2高分子纳米药物具有重要意义. 第二，目前的可控释放SO2高分子纳米药物多采用被动靶向方式递送至肿瘤部位，容易造成药物在肿瘤组织的蓄积不足，一定程度上限制了其治疗效果. 若在其表面修饰叶酸、靶向性多肽或抗体等靶向分子，赋予其主动靶向肿瘤的功能，则有望进一步增加其治疗效果. 第三，SO2气体治疗作为一种新兴的肿瘤治疗手段，与其他常见的肿瘤治疗(如肿瘤免疫疗法)手段联合的研究尚不充分. 第四，目前对SO2气体抗肿瘤作用分子机制的研究尚不完善，SO2在扰乱细胞氧化还原平衡、促进细胞凋亡时，细胞内发挥关键作用的分子、蛋白及其作用方式还未明确. 最后，高分子纳米药物在释放SO2后残留的有机小分子化合物(如2,4-二硝基苯及其衍生物)和高分子主链的药理、毒理作用需要得到进一步的阐明.