黑色素是动物皮肤和毛发中的显色物质，主要以纳米粒子的形式分布在头发毛鳞片与毛髓质之间的皮质层并嵌入在皮质层中的角蛋白纤维之间[1]. 人类头发中的黑色素含量约占1%~3%，根据化学组成和颜色的不同，黑色素又可分为真黑素和褐黑素[2]. 不同种族之间的基因差异导致毛发中的这2种黑色素含量不同，因而产生了人类多种发色的差异. 头发色素沉着和色素浓度的调节会受到诸如：新陈代谢、头发生长周期性变化、黑色素的体内分布、性别差异、药物使用(例如化疗)或某些特定的遗传疾病等诸多因素的影响和干扰[2]. 当黑色素因上述某些原因在人体中流失造成含量降低时，会导致头发变白. 据统计，开始出现白发的平均年龄为30岁左右，约50%的人在50岁时会出现显著数量的白发[2]. 虽然可通过苯胺类染发剂来对白发进行染色，但其潜在的致敏性和致癌性引起了人们的广泛关注和担忧[3,4]. 因此，寻求更为绿色的染发功能成分，用以替代传统染发剂中的毒性成分(主要是苯胺类分子)，是目前领域的主流解决策略和研究方向[5]. 近年来有大量天然分子及其衍生物被用于染发着色，均取得了一定的效果，例如单宁、类黄酮、靛蓝、类姜黄素、类胡萝卜素和一些天然色素等[5]. 但这类天然分子通常存在提取困难、产量低、稳定性差，以及染色难以持久等问题.使用黑色素及其模拟物进行染发显然是一个更为直接和理性的设计思路.在众多天然黑色素的仿生材料中[6~8]，聚多巴胺(PDA)材料因具有与天然黑色素类似的结构和功能[9~13]，被作为典型的黑色素模拟物广泛用于染发方面的研究和应用[1,14~19]. 此外，PDA等类黑色素材料还具有优异的抗氧化、抗紫外、抗癌、界面改性、能量存储和信号传输等特性[9,20~27]. 相关研究表明，在碱性条件下多巴胺发生氧化聚合导致PDA纳米颗粒成功黏附/沉积到毛发表面. 然而，基于PDA的染发剂通常需要较强的碱性氧化环境(pH9)或者金属离子(Fe3+、Fe2+、Cu2+等)的催化以引发多巴胺单体聚合，这影响了此类染发剂的生物安全性和使用依从性[1,28,29]. 因此需要开发新的人造黑色素染发材料，真实模拟天然黑色素的生物合成过程，在温和的氧化条件下快速完成聚合，以达到高效、完全的永久染色效果.生物体内天然黑色素的合成过程被认为是酪氨酸经过一系列酪氨酸酶催化的Raper-Mason途径(RMP)产生的5,6-二羟基吲哚酸(DHICA)及其脱羧衍生物5,6-二羟基吲哚(DHI)作为单体分子进一步发生氧化聚合得到的[30]. 不同于DA需要较强的氧化条件，具有更高活性的DHI能够在温和条件下仅通过空气氧化即可发生快速聚合以实现染色效果. DHI可由多巴胺经过氧化重排，发生环化生成，其聚合位点分别是2、4、7号3个位点，而未成环的多巴胺，其聚合位点只有4、7号位2个位点[31]. 此外，DHI的吲哚环主结构相比于多巴胺的苯乙胺主结构，吸电子能力增加，使得活性位点上的氢更容易离去[32]. 因此，DHI相比于多巴胺具有更高的聚合活性. 基于这些考虑，在本工作中，我们将DHI直接作为人造黑色素的单体分子，在温和条件下制得了人造黑色素材料并用于染发应用. 此外，DHI也是部分氨基酸、色胺和生物碱的中间体，因而其与毛发中角蛋白纤维之间存在多级相互作用，使其能够快速且牢固的附着在头发表面，同时，部分DHI还能够进入到头发内部皮质层，在皮质层中发生氧化聚合，生成黑色素颗粒，使染色后的毛发不易掉色，也不会受阳光辐照等光老化因素的影响. 上述结论表明，DHI能够在温和条件下实现快速聚合以及良好的染发效果，这将为开发新一代人造黑色素染发材料提供可靠的制备策略和调控方法.1实验部分1.1主要原料5,6-二羟基吲哚(DHI，98%)购自四川美拉宁高分子有限公司，碳酸氢钠(99%)、十二烷基磺酸钠(95%)购自北京百灵威科技有限公司，对苯二胺(PPD，98%)购自萨恩化学技术(上海)有限公司，商业染发剂采用欧莱雅(LREAL)臻萃植物精华油染发霜(G20151011，简称L-1011)和施华蔻(Schwarzkopf)怡然染发霜(G20140498，简称S-0498)，分别购自欧莱雅美发京东自营官方旗舰店和施华蔻京东官方旗舰店. 所有化学药品和商用染发剂均直接用于材料制备、染发实验和测试表征，未做其他预处理. 所有实验用水均为实验室制备的纯净去离子水.1.2材料制备DHI染液配置：将不同质量的DHI单体粉末溶于20 mL的去离子水中，配置成不同质量浓度的DHI染液，染液需现配现用.1.3染发实验取成束漂白发(蔻丝源美发毛条色板，9度发色)，每束质量约为1 g，使用前先用清水洗涤干净，吹干. 后将干燥的漂白发放入饱和碳酸氢钠溶液(pH=8.3)中，室温下浸泡10 min后取出并晾干. 将干燥的头发浸入配制好的DHI染液中，放入25 ℃恒温摇床中保持相应时间后将染好的头发取出、清洗、吹干.1.4黑度测试统一用色差仪(杭州彩谱，CS-660)测量头发黑度. 采用Hunter三参数法测定头发的3个主要参数值：L，a，b. 其中L值表示亮度，范围0~100，L值为0表示纯黑色，100表示纯白色，L值越小，样品的黑度越高. 对于每个样本，测量10次取平均值记录.1.5洗发实验配置5%的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液，将染好的样品发放入40 mL SDS溶液中，磁力搅拌5 min，而后用大量清水冲洗干净，干燥，记为1次洗涤. 随后在10、20、30次洗涤后，分别用色差仪测量其L值.1.6动物实验所有动物实验均经天津大学伦理委员会批准，符合中华人民共和国卫生部《动物管理条例》(批准文号: WCHSIRB-D-2017-263). 6周龄雄性KM小鼠购自成都达硕实验动物有限公司(中国成都). 使用60 mg/g PPD单体和DHI单体分别与黄原胶2%黏稠溶液混合均匀，涂抹在对应组小鼠背部皮肤表面. 分别在2 h、7天、15天后处死部分小鼠并提取染色区域的皮肤组织进行切片和染色观察.1.7测试表征将色差仪用自带黑板和白板进行色差标定，每组样品重复测5次，取平均值记录结果.采用扫描电子显微镜(SEM，Pro Phenom desktop)对染色前后的头发进行形貌分析. 通过X射线光电子能谱(XPS，ThermoFisher Thermo Scientific K-Alpha+)表征头发样品的化学结构. 红外光谱测试在Thermo scientific的NICOLET iS50 FT-IR傅里叶变换红外光谱仪上进行. 将洗干净的头发吹干，集结成束，放置在全反射ATR测量模块上进行标准化操作. 使用OMNIC软件处理光谱数据.通过紫外可见分光光度计(UV-Vis，Perkin Elmer Lambda 650)测试样品溶液的吸收光谱. 记录样品溶液在从240~800 nm的吸光度. 实验前先用去离子水进行背景扣除. 使用Applied Biosystems API 2000仪电喷雾质谱(ESI-MS)进行质谱测定，分析DHI的聚合机理.采用光学显微镜(日本基恩士VHX-6000)和三维超景深显微镜(日本基恩士VHX6000)对头发切片的内部颜色和形貌进行观察. 采用显微红外热分析显微镜(Optotherm Sentris RD)进行加热和冷却速度测试，将一部分头发集结成束，使2种头发发丝排列堆积密度相近. 把头发放置在加热台上，启动控温系统将加热台加热到36 ℃，这是人体皮肤的典型温度，拍摄此过程中头发的红外变化图像. 头发保持在30 ℃左右. 一段时间后关闭温控台，自然降温，用红外摄像机记录头发的红外图像和温度. 实验期间的室温在15 ℃左右. 力学性能通过电子单纤维强力仪进行测试(莱州市电子仪器有限公司LLY- 06B)，夹具间隙10 mm.2结果与讨论2.1人造黑色素材料染色效果分析选取9度发色成束漂白发浸入饱和碳酸氢钠溶液10 min后取出并晾干，将干燥头发浸入相应浓度的DHI染液中，利用空气氧化DHI聚合，进行染色和耐洗涤效果测试(图1(a)). 实验结果表明，DHI单体通过接触空气这种温和氧化剂空气就能直接进行聚合反应生成黑色素并显现颜色. 如图1(b)所示，随着DHI初始浓度增加，头发着色程度加深. 与漂白发色度变化情况类似，前0.5 h的L值迅速降低，继续延长染发时间，L变化值趋于平稳(这里将染黑后的头发样品分别命名为PDHI-i，i = 1~6，对应不同DHI初始浓度)，其中PDHI-4和PDHI-5两种浓度对应头发样品的着色情况和L值可达到商用染发剂L-1011和S-0468同样的染色效果. 值得注意的是，着色后用十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液清洗数次，经PDHI-4和PDHI-5染色的头发，L值基本不变，表明DHI聚合染色后的头发经过多次洗涤后，仍旧保有良好的着色效果且不会产生明显的褪色，是一种永久性上色的原料，其稳定性和耐洗涤性也可媲美商业染发剂.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23184.F001Fig. 1(a) Schematic illustration of the fabrication process towards DPHI hair dye material. (b) Photographs and (c) blackness of human gray hair dyed with 1, 2, 4, 8, 16, 32 mg/mL of DHI, which named PDHI-i (i = 1‒6), respectively. L-1011 and S-0468 are two types of commercial hair dyes. (d) Photographs of PDHI-4, PDHI-5, L-1011 and S-0468 after washed several times and (e) corresponding blackness changes.2.2白发染色后的物理结构分析通过SEM测试评估真人白发样品染色后的物理形貌. 如图2(a)所示，随着DHI染液初始浓度增高，头发样品表面附着的聚合物涂层逐渐密实，表明PDHI在头发表面也能很好地沉积与附着. 当DHI初始达到32 mg/mL时，头发表面的附着层明显变厚变粗糙，说明附着量已达到上限，这与上述染色结果对应. 相比之下，PDHI-4的附着情况在保证黑度满足应用的前提下最大程度地保留了头发完整的毛鳞片结构，这与L-1011和S-0468 两种染发核心成分为对苯二胺的商用染发剂染发后的SEM图像类似，表明基于DHI的人造黑色素染发剂与商用染发剂具有同样优异的头发表面附着能力. 使用环氧树脂将头发固定并切片，通过光学显微镜观察头发的横截面(图2(b))，可以看出相比于未染色的原始漂白发，经DHI染色后的头发由内及外均呈现均匀的黑色，且经过30次洗涤后未发生褪色现象且着色均匀. 三维超景深显微镜的结果(图2(c))也证实了这一点. 染发后和洗涤后的头发内部均有人造黑色素聚合物的存在(图2(c)中箭头标出). 这是因为头发是由角蛋白构成的，含有大量的羧基、氨基和羟基等极性官能团，在DHI的氧化聚合过程中会产生多种共价和非共价相互作用(如迈克尔加成、席夫碱、π-π相互作用等)，从而形成较强的结合[28]. 综上可推测基于DHI单体的人造黑色素染发过程如下：首先通过饱和碳酸氢钠溶液(pH=8.3)使头发溶胀并打开表层毛鳞片，促进DHI和低聚物渗透进入头发皮质层，这些分子进入头发后在弱碱环境和空气氧化的作用下变成吲哚醌再发生聚合形成大分子黑色素从而无法通过毛鳞片而保留在头发皮质层中. 随后可通过洗涤护理过程使表皮层闭合并洗去表面残留物质以保持发质健康并最终实现永久性染发效果.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23184.F002Fig. 2(a) SEM images of the raw human gray hair sample, PDHI-i (i = 1‍‒6) dayed hair samples and the commercial hair dye treated hair samples. (b) Hair microphotographs and (c) three-dimensional ultra-depth of field microscope of commercial bleached hair sample (Raw), 8 mg/mL DHI dyed sample (PDHI-4) and this sample washed 30 times.2.3染发过程中聚合机理研究为了进一步研究DHI在染发条件下的聚合机理，分别提取PDHI-4组初始10 min以及24 h的染发反应原液进行ESI-MS质谱分析，如图3(a)所示，DHI 在聚合的早期阶段多以二聚体和四聚体的形式出现(m/z = 283.1，m/z = 612.3)，表明DHI单体聚合活性较高. 从低聚物的结构上看，反应活性最高的位点是2号位，其次是4号位和7号位. 这些位置的相对反应活性最近也被密度泛函理论计算的通用反应性指标所证实[33]. 理论预测表明，DHI的二聚是通过DHI的2号位与其邻苯二醌形式的4号位或7号位之间的电子转移控制反应进行的. 24 h后DHI聚合液中低聚物含量明显降低，出现了m/z = 1130.5的信号，推测结构应该是对应的七聚体，表明继续延长聚合反应时间，DHI能够以更大分子量的低聚体参与后续聚合. 更大的分子量意味着更高密度的极性基团，如邻苯二酚，这有利于增强染发剂与头发的相互作用，以促进更好的附着，产生更黑的染色效果，但过长的染发时间一方面不利于实际染发操作，另一方面人造黑色素容易在头发表面过量沉积，从而破坏毛发本身的表观形貌和性质.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23184.F004Fig. 3(a) ESI-MS spectra of the raw solution for PDHI-4 after 10 min and 24 h reaction and the possible intermediate structures proposed from the main peaks. (b) XPS survey scan of the raw human gray hair sample and the PDHI-4 dyed hair sample. High-resolution spectra for (c) C1s, (d) N1s, (e) S2p of the PDHI-4 dyed hair sample. (The online version is colorful.)进一步通过XPS评估PDHI-4染色后头发冻干粉末样品的化学结构. 图3(b)中的全谱扫描和元素定量分析结果表明，PDHI-4染色后的头发样品，C、N元素占比分别从60.8%、2.6%增加至70.4%、3.2%，S元素则从14.5%降低到了6.1%，这表明含氮人造黑色素与头发的成功结合.经过分峰拟合处理，样品的C1s区域分别归属于C－C (284.6 eV)、C－O/C－N (285.7 eV)和C＝O/C＝N (288.6 eV) (图3(c)). N1s区域分别归属于吲哚氮(Indole N，399.5 eV)和R-NH2 (402.5 eV). 值得注意的是，Indole N的极大占比(图3(d))进一步证实了DHI吲哚结构的成功引入. 人类毛发以角蛋白为基本单元构成，其中角蛋白以α-螺旋的形式存在. 多根角蛋白互相卷绕、绑定成束，并依次形成原纤维、中间丝、微丝等层级结构. 这些结构之间通过二硫键(―S－S－)交联，最终形成毛发. PDHI结构中的邻苯二酚由于具有较强的还原性且能够活化邻位双键，因而能够与头发中的二硫键发生迈克尔加成反应进行共价偶联. 通过图3(e)中168.0 eV处－C－S键的出现，推测可能有上述迈克尔加成反应的发生.2.4白发染色后的物理性质DHI和相关的低聚物会渗入头发皮质层中并聚合成为大分子人造黑色素，同时也可以覆盖在头发表面，通过头发的单纤维拉伸性能测试可以探究染色后头发的力学性能变化(图4(a)). 结果表明，由于DHI与头发中的成束角蛋白链之间具有共价偶联和非共价多级相互作用，使得经DHI染色后的头发断裂强度和断裂伸长率均有所增加，表明经人造黑色素染发剂染色的头发具有更强韧的发质. 值得注意的是，随着DHI初始浓度的增加，染色后头发的力学性能呈现先增强后下降的趋势，这主要是因为适量的PDHI能够通过与头发的多级相互作用促使角蛋白链间的交联，而当含量过高时，由于PDHI自身的π-π致密堆积和较厚的表面沉积，会改变毛发本身的发质，表现为力学性能受损.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23184.F003Fig. 4(a) Representative stress-strain curves of natural black hair and human gray hair after L-1011 and PDHI-i (i = 1‍‒‍6) dyeing. (b) Frictional heat generation of hair before and after dyed with PDHI-4. (The online version is colorful.)人体毛发的一个重要功能是帮助头皮温度维持在相对恒定的范围[34]. 为了研究DHI染发后的人造黑色素对头发导热速率的影响，对头发进行升降温实验. 如图4(b)所示，相比于未经染色处理的白发，当头发表层温度升高10 ℃时，DHI 染色后的头发所需升温时间从35 s增加到60 s. 同样的，降温9 ℃，DHI染色后头发所需降温时间从150 s延长到320 s，升降温所需时间均增加了1倍左右，表明用DHI聚合物染发具有良好的保温效果，可以一定程度上提升受众在应对日常气温变换时使用此类染发剂的依从性体验.2.5人造黑色素染发剂的生物安全评估通过小鼠皮肤涂抹实验研究人造黑色素染发剂的生物安全性. 选取目前市售染发剂中最常用的核心染发功能组分对苯二胺(PPD)作为生物安全性评估对照，选取商用允许最大添加量60 mg/g作为统一浓度，将PDHI-4和PPD分别分散到2%的黄原胶中，以模拟染发膏的形式，涂抹到小鼠背部裸露皮肤上(图5(a))，接触时长为2 h，以模拟染发过程和时间. 随后取小鼠背部皮肤组织切片进行染色观察. 从图5(b)和5(c)中可以看出，涂抹PPD的小鼠背部皮肤角质层明显变薄且受损严重，甚至出现缺失，毛囊形态异常，而涂抹PDHI-4的皮肤组织切片与空白对照组无异. 随后将染膏停留时长分别延长至7和15天以模拟残留染膏长期附着对皮肤的影响时，同样可以看出涂抹PPD组的小鼠皮肤角质层受损，毛囊形态和纤维组织取向异常，而涂抹PDHI的皮肤和空白对照组组织切片结构无异，研究中所有小鼠均成活，未观察到水肿等皮肤病. 这些结果表明，PPD可能导致严重的毒理学问题. 上述结果表明，在允许范围内的最高浓度情况下，通过DHI聚合进行染发不会对人体皮肤及健康产生危害，因此DHI有望成为可商用的安全无毒染发原料.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23184.F005Fig. 5(a) Schematic diagram of a mouse treated with PDHI-4 dying. (b) H&E and (c) Masson images of the mouse back skin in contact with the hair dye.3结论模拟人体毛发中黑色素的生物合成过程，在温和条件下，仅依靠空气氧化，即可诱导DHI在头发表面和内部皮质层快速聚合形成大分子黑色素材料，从而实现永久性染色的效果. 相较之下，传统PDA型染发剂条件更为苛刻，通常需要更强的碱性条件或金属离子参与聚合反应，对发质造成损伤的同时还存在潜在的毒性问题. 我们通过色度仪，电子显微镜等表征证实，人造黑色素染发材料能够均匀的附着在头发表面，部分单体和低聚物还会进入到头发的皮质层中发生聚合，使得染色之后的头发经洗涤不易掉色. 通过动物毛皮接触实验，证明其生物安全性相较于商用苯胺类染发原料更优. 因此，基于DHI的新型人造黑色素染发剂具有作为下一代绿色安全的商用染发剂的潜力. 值得一提的是，由于DHI本身的酚醌异构特性，使其能够形成局部“给-受体”对微结构，因而可通过对人造黑色素染发材料的能级结构进行调控来进一步增强黑色素的黑度[13,32,35~39]，这样可以在低使用量的情况下同样获得良好的染黑效果. 本工作为新一代高效安全的仿生染发剂的开发和应用提供了新的机会.