聚肽是一类以氨基酸或者氨基酸衍生物为重复单元的合成聚合物，兼具合成聚合物与生物高分子(蛋白质)的特点[1~3]，关于其可控合成、结构特点以及功能应用等一直受到学者们的广泛关注. 聚肽具有有序的二级结构，例如α-螺旋和β-折叠[4,5]，这2种构象都支持聚肽在组装过程中形成有序结构. 对聚肽的不断深入研究不仅提高了人们对天然蛋白的认识，同时也推动了生物相关功能材料的设计与制备的发展[6~17]. 因此，关于聚肽的合成及其自组装研已经成为高分子领域和生物医学领域的重要研究方向. 例如，He课题组通过调节选择性共溶剂中的水/甲醇的比例用聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯) (Py-PBLG)制备了包括纺锤状和柱状形貌的各向异性胶束[18]. 此外，他们还发现了两亲性聚肽嵌段共聚物聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-嵌段-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)在溶液中能够自组装形成带有孔洞的圆盘胶束[19]. 近些年来，我们课题组围绕聚肽自组装行为及其机理开展了系列研究，制备了超螺旋(螺旋球、螺旋环和螺旋棒等)、多级纳米线和捆绑纳米束等形貌丰富的纳米结构[20~26]，加深了对聚肽自组装体系的认识.卟啉及其衍生物是一类具有优异光敏性质的小分子[27]. 由于其高度共轭的平面结构，具有刚性、易修饰等特点，这使得卟啉及其衍生物在构建自组装体系、研究自组装行为和制备功能化材料方面有着潜在价值[28~32]. 用卟啉及其衍生物改性聚肽聚合物，能够整合两者的优势，有望为聚肽自组装带来更加独特的形貌特征，并赋予聚肽组装体更广阔的应用前景.本文报道了卟啉衍生物改性聚肽均聚物体系(TFPP-PBLG)的自组装行为. 研究发现，TFPP-PBLG可以在溶液中自组装形成碗状聚集体. 研究了PBLG链段长度对于自组装聚集体形貌的影响，发现随着PBLG链段长度增加，自组装聚集体的凹坑变得不明显. 基于TFPP-PBLG聚合物链段的分子间作用力的协同作用以及聚合物链段长度对自组装体形貌的影响，提出了卟啉衍生物改性聚肽均聚物自组装形成碗状聚集体的机理.1实验部分1.1主要实验原料四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、炔丙基胺均为分析纯，购自上海泰坦科技有限公司，直接使用. 无水二氯甲烷、五氟苯甲醛、4-叠氮四氟苯甲醛、吡咯、三氟化硼乙醚、石油醚、三氟乙酸、亚硝酸钠、叠氮化钠和甲醇均为分析纯，购自上海玻尔化学试剂有限公司，直接使用. 对四氯苯醌、氯化亚锡和乙酸乙酯均为分析纯，购自上海麦克林生化科技股份有限公司，直接使用. 二氧六环，分析纯，购自上海泰坦科技有限公司，经金属钠回流除水后使用. γ-苄基-L-谷氨酸酯五元环酸酐化合物(BLG-NCA)单体，实验室自制[33~35]. 超纯水(18.2 MΩ·cm)由(德国Merck Millipore, Direct-Q 8 UV Remote)制备得到. 透析袋(截留分子量3500)，购自上海振建生物科技有限公司.1.2带有炔丙基端基的PBLG均聚物(CH≡C―CH2―PBLG)的合成图1为CH≡C―CH2―PBLG的合成路线. 以精制的二氧六环作为溶剂，用炔丙基胺作为引发剂，引发BLG-NCA单体进行开环聚合. 反应3天后，所得到的反应液用水透析，得到白色粉末状固体(潮湿)，冷冻干燥后，得到CH≡C－CH2－PBLG.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F001Fig. 1Synthetic route of propargyl-PBLG.1.3带有单叠氮基团的全氟代四苯基卟啉(TFPP-N3)的合成图2为TFPP-N3的合成路线，主要包括以下3个步骤：(1) 将五氟苯甲醛、4-叠氮四氟苯甲醛、吡咯按一定比例溶于无水二氯甲烷中，在氮气保护下，以三氟化硼乙醚为催化剂，避光反应4 h. 随后继续往里加入对四氯苯醌，50 ℃反应2 h. 待反应结束后，用甲醇低温重结晶6 h，进行抽滤，继续用甲醇冲洗上层滤渣. 最后对滤渣进行干燥，得到TFPP-N3粗产物，需在后续步骤进一步提纯. (2) 将粗产物和等摩尔的氯化亚锡，在氮气保护下，室温反应2 h. 最后以乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂为洗脱剂，用柱色谱提纯，得到纯度较高的TFPP-NH2. (3) 将TFPP-NH2溶于三氟乙酸，将溶有亚硝酸钠的去离子水溶液缓慢滴入三氟乙酸中，0 ℃反应0.5 h. 随后将溶有叠氮化钠的去离子水溶液缓慢滴入之前的溶液中，室温反应0.5 h，待反应结束，再用去离子水洗涤，并用二氯甲烷萃取. 最后以纯二氯甲烷为洗脱剂，用柱色谱提纯，最终得到所需的TFPP-N3.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F002Fig. 2Synthetic route of TFPP-N3.1.4卟啉衍生物改性聚肽均聚物(TFPP-PBLG)的合成图3为TFPP-PBLG的合成路线，主要包括以下2个步骤：(1) 在氮气保护下，将溶于氯仿的TFPP-N3和溶于甲醇的二水合醋酸锌混合搅拌4 h. 随后加入一定量的二氯甲烷，用水洗涤3次，得到TFPP-N3(Zn2+). (2) 将TFPP-N3(Zn2+)，CH≡C―CH2―PBLG和CuSO4⋅5H2O按一定比例溶于四氢呋喃中，在氮气保护下，缓慢加入抗坏血酸钠的水溶液，室温反应48 h，得到TFPP-PBLG (聚合物的相关参数见表1).10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F003Fig. 3Synthetic route of TFPP-PBLG.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.T001Table 1Characteristics of polymers.SampleDPPBLG aMn b (kg/mol)Ð bTFPP-PBLG21215.61.32TFPP-PBLG35358.61.36TFPP-PBLG5050121.25a Calculated from 1H-NMR; b Determined by GPC in DMF with calibrated PBLG standards.1.5组装体的制备将TFPP-PBLG溶于THF中，配置成0.5 g/L的聚合物原液. 取200 μL原液置于10 mL样品瓶中，按照溶剂比例(VTHF:VDMF = 3:7)，补加THF和DMF，配置成体积为1 mL (浓度为0.1 g/L)的聚合物溶液. 待混合均匀，在所需实验温度下缓慢搅拌，以10 μL/min的速率滴入300 μL超纯水. 聚集体溶液需要在相应温度下继续稳定不少于6 h. 将溶液倒入透析袋中，用去离子水透析3天，得到聚集体水溶液. 在后续的测试前样品需稳定不少于3天.1.6测试方法与仪器1.6.1聚合物的结构分析采用傅里叶变换红外光谱(FTIR，美国热电公司，Nicolet 5700型，压片法制样)、核磁共振氢谱(1H-NMR，德国Bruker，Ascend 600)和紫外-可见光光谱仪(UV-Vis，日本Shimadzu，UV-2550)表征聚合物的化学结构. 凝胶渗透色谱(GPC，英国Varian，PL GPC-50 plus，DMF/LiBr为溶剂，窄分布的PBLG均聚物为标样)，测定聚合物的分子量及分布.1.6.2聚集体形貌和结构表征采用扫描电镜(SEM，日本Hitachi，S4800)、原子力显微镜(AFM，韩国Park Systems，XE-100)和透射电镜(TEM，日本JEOL，JEM-1400)观察聚集体形貌. SEM测试样品需喷铂以增强导电性. 通过动态激光光散射(DLS, 德国ALV-5022F，氦氖激光光源，波长632.8 nm)表征聚集体的流体力学半径Rh.1.6.3聚合物溶液的浊度测试采用紫外-可见分光光度计(UV-Vis，日本Shimadzu，UV-2550，波长690 nm)测定聚合物溶液在不同加水量下的浊度.1.6.4聚集体溶液的SAXS测试采用小角X射线散射仪(SAXS，奥地利，Anton paar Saxsess MC2)表征组装体内部微结构.2结果讨论2.1聚合物的结构表征采用1H-NMR、FTIR、UV-Vis和GPC表征聚合物结构. 图4为TFPP-PBLG的核磁共振氢谱图. 如图所示，δ=9.00 (1) 归属于分子中吡咯环的质子峰，δ=2.23 (2)和4.00 (3)处的吸收峰分别归属于―CH＝C―和―CH＝C―CH2―基团，δ=4.60 (4)处的吸收峰为PBLG主链中―CH―的质子峰，δ=1.92 (5)和2.45 (6)则分别对应了PBLG中β和γ位的―CH2―的吸收峰，δ=5.07 (7)的吸收峰为侧链苯甲基的质子峰，δ=7.27 (8)的吸收峰为侧链苯环的质子峰以及溶剂(CHCl3)的质子峰.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F004 Fig. 41H-NMR spectrum of TFPP-PBLG in CDCl3 (tetramethylsilane as internal standard).图5为TFPP-N3、CH≡C－CH2－PBLG和TFPP-PBLG的红外吸收谱图. 对于TFPP-PBLG，2124 cm-1处的叠氮基团红外吸收峰的消失代表TFPP-N3和CH≡C－CH2－PBLG反应完全. 1733、1650和1548 cm-1位置的吸收峰代表PBLG的酯键和仲酰胺基的伸缩振动，同时也说明了PBLG主链以α-螺旋构象存在. 位于750和697 cm-1处的吸收峰对应于PBLG侧链上的苯甲基. 这些PBLG红外吸收峰的存在进一步证明了TFPP-PBLG合成成功.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F005Fig. 5FTIR spectra of TFPP-N3, propargyl-terminated PBLG and TFPP-PBLG.图6为TFPP-PBLG的UV-Vis图谱. 将TFPP-PBLG溶于THF中，并对聚合物溶液进行300~800 nm的谱图扫描，可以看到，在420 nm附近出现了明显的强吸收峰，并且在500~700 nm范围内有存在一定强度的弱吸收峰. 卟啉及其衍生物的光谱在400~450 nm有强的Soret带吸收以及在500~700 nm有比较弱的Q带吸收峰[27]. 紫外-可见光光谱的测试结果也证明了所得到的聚合物合成成功.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F006Fig. 6UV spectrum of TFPP-PBLG.通过上述1H-NMR、FTIR和UV-Vis表征，证实了TFPP-PBLG的成功合成，并根据1H-NMR结果计算了聚合物的数均分子量及PBLG链段的聚合度. 进一步采用GPC表征了聚合物的分子量分布系数(Ð)，表明这些聚合物具有较窄的分子量分布系数. 聚合物的结构参数列于表1.2.2自组装体形貌的表征图7(a)~7(c)显示了TFPP-PBLG21自组装形成聚集体的形貌图. 通过SEM、TEM和AFM观察看出，TFPP-PBLG21自组装形成了尺寸均匀、呈现出椭球形的碗状纳米结构. 根据SEM图像，纳米碗的长径和短直径分别约为205和165 nm. 如图7(b)所示，TEM图中明暗衬度的区别凸显出了聚集体的凹坑特征. AFM高度图显示了碗状结构中心部分的凹陷深度约为10 nm(图7(c)和7(d)). 图7(b)中插图为聚集体的流体力学半径分布图，可以发现碗状纳米结构的平均流体力学半径(Rh)约为67 nm，且Rh分布相对较窄.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F007Fig. 7Typical SEM image (a), TEM image (b), and AFM image (c) of aggregates formed by TFPP-PBLG21. (d) AFM height profile along the red line in (c). Inset plot in (b) is hydrodynamic radius distribution of the aggregates in solution. Scattering angle is 90°.2.3TFPP纳米碗的形成机理为了深入理解卟啉衍生物改性聚肽纳米碗的形成机理，探讨了碗状胶束形成的动力学过程. 图8为聚合物溶液的浊度随水含量变化的曲线图. 如图所示，当水含量达到7.4 vol%，体系浊度突然变大，表明TFPP-PBLG21聚合物聚集体的形成. 随着水含量的增加，体系的浊度急剧上升，并且当溶液的水含量超过18 vol%之后，溶液的浊度值逐渐趋于稳定，表明该聚合物的自组装行为基本完成.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F008Fig. 8Turbidity (optical density) curve of TFPP-PBLG21 as a function of water content. The insets show the corresponding SEM images of the representative intermediate morphologies at various water contents. All scale bars are 300 nm.相应地，通过SEM观察了不同的溶液水含量下(包括小于18 vol%的部分)形成的聚集体的形貌特征. 为了能够得到当前水量条件下的聚集体形貌，当加水量达到目标值时，采用先冻结(将聚集体溶液注入其10倍体积的去离子水中)后透析的方法进行实验. 可以观察到，当含水量为7.4 vol%时，TFPP-PBLG21形成了尺寸很小的球状聚集体，其直径约为40 nm. 当水量增加到12.3 vol%时，观察到椭球状聚集体的出现，其尺寸约为285 nm. 随着水量进一步增加，椭球状聚集体始终存在，但并未观察到带有凹坑的碗状结构. 当含水量达到23.1 vol%时，椭球状聚集体数量变多，但其表面光滑，始终没有观察到碗状结构.为了原位监测上述过程，测量了在不同加水量下TFPP-PBLG21所形成组装体的Rh值. 如图9所示，当含水量为7.4 vol%时，所形成初始聚集体的平均Rh值约为26 nm，分布较窄. 随着水量的增加，平均Rh向较高值移动，并且Rh分布变宽，对应于体系中的初始球状聚集体逐渐转变为椭球状聚集体. 水量进一步上升，Rh值进一步增加，体系中形成了更多的椭球状聚集体.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F009Fig. 9Plots of the Rh distribution of aggregates assembled from TFPP-PBLG21 at various water contents.形貌表征的结果表明，在整个加水组装的过程中，聚集体一直没有出现凹坑结构. 由此推断，碗状结构不是在组装时形成的，可能是在组装完成之后的透析过程中形成的.为了考察透析过程是否会导致碗状结构的生成，首先固定水量为23.1 vol%，稳定时间为3 h，将聚集体溶液透析相应时间后，取样冻结再进行透析. 图10为TFPP-PBLG21所形成的胶束先透析一定时间再冻结后正常透析的聚集体SEM图和TEM图. 如图10(a)和10(e)所示，对于透析时间为0 min，即直接冻结后透析的聚集体溶液，会生成表面光滑没有凹坑的实心椭球体形貌；当透析时间为5 min时，观察到椭球体的表面会生成缺口(图10(b)和10(f))；当透析时间增加到10 min时，如图10(c)和10(g)所示，观察到球状形貌的表面已经形成明显的凹坑结构；随着透析时间进一步增加，碗状形貌稳定不变(图10(d)和10(h)).10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F010Fig. 10Typical SEM (a‒d) and TEM (e‒f) images of aggregates formed by TFPP-PBLG21 under different dialysis time: (a, e) 0 min, (b, f) 5 min, (c, g) 10 min, (d, h) 20 min.基于以上实验结果，对TFPP-PBLG聚合物自组装形成碗状纳米结构的机理进行了分析. 在初始THF/DMF共混溶剂中，TFPP-PBLG聚合物溶解良好；随着不良溶剂水的加入，聚合物开始聚集形成胶束. 在该聚合物中，TFPP相对较为疏水，而PBLG链段由于含有大量的酰胺键和酯键表现出相对较为亲水的性质[36]，因此TFPP组分倾向位于组装体内部，PBLG链段倾向位于组装体外侧保持其在溶液中的稳定分散. 由于TFPP间强烈的π-π堆叠作用，形成的胶束结构较为稳定.初始形成的胶束内部含有大量的有机溶剂，在后续的透析过程中，有机溶剂逐渐从内部向外扩散，但外界的水难以扩散进入胶束疏水内部，由此产生了胶束内向塌缩的可能性，胶束具有重组装或变形调整的趋势. 然而，TFPP间强烈的π-π堆叠作用限制了聚合物链段的运动及胶束的结构重组，最后导致了胶束外壳的局部塌陷，形成凹陷. 随着溶剂进一步的扩散，凹陷变大，形成碗状纳米结构[37~39](示意图1).10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.C001Scheme 1Schematic representation of the formation of bowl-like aggregates.上述机理分析中说明了TFPP间强烈的π-π堆叠作用对纳米碗形成的重要作用. 为进一步验证纳米碗的形成机理，采用SAXS表征组装体透析前后的内部微结构(图11). 在q = 4.68 nm-1处的出峰对应于相邻PBLG分子间的距离(1.34 nm)[20]. 不冻结直接透析的样品在该处具有明显的出峰，表明胶束内部PBLG链段有序堆积. 而先冻结后透析的样品没有明显的出峰，表明内部PBLG链段的有序度较低. 因此，直接透析的样品内部堆积排列更有序，这得益于透析过程中聚合物链段的重排，进而形成了更加有序的胶束内部结构.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F011Fig. 11SAXS spectra of aggregates formed by TFPP-PBLG21 with and without frozen before dialysis.同时，我们开展了以下2组对照实验. (1) PBLG均聚物的自组装行为研究. 在相同组装条件下，发现用于合成上述TFPP-PBLG聚合物的PBLG均聚物(DP = 21)只能形成椭球状聚集体(图12)，而不能形成碗状聚集体，该结果表明卟啉衍生物的引入对于该体系碗状聚集体的形成是十分重要的. (2) PBLG聚合度不同的TFPP-PBLG的组装行为研究. 通过改变PBLG链段长度的方式来调节体系中的分子间相互作用力，考察了这一因素对碗状形貌的影响. 图13显示了不同PBLG链段长度的TFPP-PBLG聚集体形貌的SEM图，如图所示，增加PBLG链段的长度(聚合度从21增加到35和50)，无法得到带有明显凹坑结构的碗状胶束. 刚性的PBLG链段之间倾向于有序排列，其长度的增加有利于有序排列现象的发生；这种PBLG链段的有序排列使得聚集体内部链段排列更加紧密有序[25]，组装体的稳定性增加，因此由含有较长PBLG链段的TFPP-PBLG所形成的胶束难以进一步凹陷形成纳米碗. 这些现象强调了胶束的结构稳定性是决定其在后续溶剂交换过程中是否发生凹陷从而形成纳米碗的重要前提条件.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F012Fig. 12Typical SEM (a) and TEM (b) images of aggregates formed by propargyl-PBLG21 homopolymers.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23196.F013Fig. 13Typical SEM images of aggregates formed by TFPP-PBLG with various PBLG chain lengths: (a) TFPP-PBLG35 and (b) TFPP-PBLG50.本文工作通过含卟啉聚肽自组装，得到了带有明显凹坑的碗状胶束，发现了卟啉基团间的作用力是碗状结构形成的关键. 这种碗状胶束由于含卟啉衍生物可用于光动力学治疗，在生物医用领域具有潜在的应用价值. 本研究工作丰富了聚肽自组装体体系的形貌研究，对功能化聚肽的制备具有一定指导意义.3结论通过点击反应构建了含卟啉聚肽，研究了其在溶液中的自组装行为，分析了分子间相互作用力对碗状形貌的影响. 研究发现，TFPP-PBLG聚合物可以在溶液中组装形成碗状胶束. 随着选择性溶剂水的加入，聚合物首先组装形成胶束. 由于卟啉间的π-π堆叠作用，胶束结构稳定性较高. 在透析过程中，胶束内部溶剂向外扩散，而水不能进入胶束内部，由此导致胶束外壳塌陷形成凹坑得到纳米碗.