1研究背景研究高分子链的构象变化、组装行为及其发生机制是高分子科学的基础问题. 这不仅决定了高分子材料的合成、性能和应用，还对生物大分子相互作用和生化反应体系的研究有着深远的影响. 然而，由于传统分析方法的限制，人们一直难以在微观层面上实时原位监测单链高分子的构象和组装体. 分子动力学模拟可以预测和解释大分子的结构、动力学、热力学以及材料特性，但面临着结构精度和时间尺度此消彼长的问题和计算成本的考量[1]. 对于生物大分子来说，几乎所有已知的蛋白质结构都可以通过AlphaFold进行精确预测[2]. 然而，AlphaFold对动态多变的结构，比如蛋白的无序区——最简单的高分子链之一，预测准确率尚不尽如人意. 而对于动态过程，比如溶液态蛋白质不同构象之间的转化过程的预测则更将困难. 突破这些局限性对于我们了解执行重要生命功能的生物大分子体系至关重要. 理清蛋白质、核酸、多肽分子的功能和反应机理对分子生物学和医药科学等领域的进展有根本性影响[3]. 另一方面，除了蛋白质以及其他生物大分子体系[4]，对于合成高分子及其组装体系的分析和表征也将制约高分子——目前应用最广泛的化学分子——材料设计以及其在国计民生各方面的应用. 具体来说，解析溶液态高分子构象态之间的转化动力学和中间态形成机制，尤其是罕见高能级构象态，是分子相互作用机理研究的核心问题和技术难点，对于理解化学反应结构与功能的关系、高分子结构与宏观力学性质的关系、高分子物理和生物医学等具有重要意义.1.1高分子与组装体的表征手段经典的高分子表征方法丰富多样且简便高效，但是通常难以提供时空分辨率兼备的原位分子信息. 凝胶渗透色谱法(GPC)可以根据流体力学体积大小差异将不同分子量的高分子进行分离，得到高分子的分子量分布和数均分子量等信息. 光散射技术，如静态光散射(SLS)和动态光散射(DLS)，可以结合使用来获得高分子体系的分子量、粒径分布以推测分子链构象等信息，也可跟踪聚合、组装和降解等过程[5]. 流变仪可以测试高分子的流变性质，并通过测量其对剪切流场的响应获取相关参数，指导高分子材料的加工[6].目前大分子结构分析手段主要包括X射线衍射、中子和电子的散射或衍射；这些方法具备原子级空间分辨率，可以测量样品精细结构，但是这些系综方法无法揭示单分子的异质性. 例如，X射线衍射方法适用于解析高分子的精细结构，但不少生物大分子的高质量单晶获取困难. 而晶体结构是分子最稳定的构象，溶液态中存在的丰富亚稳态构象以及构象的动态变化等信息，通常需要通过其他测量方法获取. 红外或拉曼光谱法提供了有关分子链构象研究、分子聚集态研究及结晶度等方面的信息[7]，小角X射线散射(SAXS) 则帮助我们获取晶体/非晶/溶液等样品的1~10 nm左右长周期特征[8]. 中子散射/反射法(neutron scattering/reflectivity) 主要利用衍射强度信息确定晶体中氢原子的位置，与X射线衍射结合使用可以得到更准确的分子结构和原子分布[9]. 此外，电子衍射法(low energy electron diffraction)可以提供聚合物单晶的形貌和结构信息，但实验需要仔细考量成像条件，评估样品所受的辐射损伤[10]. 液体核磁(solution NMR)是经典的高空间分辨的原位测量溶液态分子体系的方法，其广泛应用于解析核酸和蛋白的结构、链间相互作用、结晶、相容性以及构象转化等，其优势在于检测分子本征化学位移值，无需标记引入干扰信号. 但受核磁检测的信号灵敏度的限制，该方法难以捕获低丰度的中间态结构 (低于总分子数的20%)；同时也由于采谱时间的限制，通常难以实时捕捉瞬态过程[11].通过对分子体系进行位点特异的荧光标记，检测信号灵敏度的问题得到解决，监测化学体系中的单分子动态过程得以实现. 通过对高分子进行单链标记，荧光相关光谱(FCS)可以得到分子扩散系数等信息. FCS具有很高的灵敏度，与DLS (回转半径Rg5 nm)不同的是，它不受聚合物分子量的影响，可以测量1 nm左右染料分子的扩散系数. FCS可通过特定组分标记实现复杂体系的研究，如分子相互作用和结合等，通过检测单个标记信号的荧光涨落的自相关函数或者或2种荧光信号的互相关函数，得到分子构象变化和分子间结合等信息. FCS存在标记困难、光漂白以及光谱串扰等问题[12]. 相较于系综测量，单分子成像方法能够观察单链高分子动态和反应的异质性，遗憾的是通常无法兼具时空分辨率. 例如：使用荧光标记对核酸结合蛋白在DNA上的搜索过程进行在全内反射荧光(TIRF)模式下进行单分子水平的追踪[13]，解析到丰富的时间依存DNA旋转搜索模式，但是空间分辨率难以解析蛋白域在该过程中的调整适应过程. 将供体和受体标记在高分子两端，通过测量2种标记染料之间的福斯特共振能量转移(FRET)现象(荧光强度变化和寿命变化)，定量分析亚纳米尺度的分子构象变化，将TIRF和FRET联用，能很好地捕捉分子原位动态变化. 三色FRET成功揭示了染色质重塑过程中核糖体介导的DNA运动行为[14]. 但是，由于多位点标记困难、光谱串扰等原因，FRET方法难以同时表征多位点的相对距离变化，即多位点的实时构象变化. 基于荧光的单分子方法具有一定的局限性：一方面，受限于光学衍射极限，分子的动态过程的解析通常依赖于对荧光染料分子信号强度变化，而新兴的超分辨成像技术——受激发射损耗显微镜(STED)、光激活定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)，实验室通常的空间分辨率20 nm，最近的最小荧光发射(MINFLUX)方法报道的2 nm的分辨率让人振奋，然而广泛应用还需时间；另一方面，向高分子链引入带有较大共轭基团的荧光标记可能会对高分子链的物理性质和所参与历程产生影响.其他常见的单分子包括光镊或磁镊，两者均能实时解析高分子单链构象变化，但均需要配套的外加场微机械操控测量，目前主要用于解析染色质等生物大分子相互作用[15]. 光镊和磁镊的数据解读往往存在困难，其得到的通常也是检测信号强度随时间变化的数据. 因此，我们需要更加直观的溶液态单分子的直接成像. 实验目前广泛应用的是快速扫描原子力显微镜(AFM)，目前已经实现了对核酸构象、核酸-蛋白搜索过程的成像，并解析到蛋白分子的构象变化. 但由于AFM的检测信号来自样品分子与AFM探针针尖的相互作用力曲线，数据通常局限于分子表面的形貌变化[16]. 也因此，样品分子通常需要和基底有比较强的作用使之被部分固定，影响分子体系本征的动力学过程.在目前已发展的大分子测量手段中，系综方法掩蔽了单分子异质性，难以捕捉中间态、亚稳态信息；现有的单分子方法难以兼备测量分子构象变化所需的时空分辨率且由于测量原理所限需要对样品进行标记或施加外力使其偏离本征溶液态行为. 新兴的液相电镜技术以其兼具原子级空间分辨率与毫秒级时间分辨率的优势，已经成功实现了对无标记的溶液态高分子的实时原位成像，获得有关高分子单链构象转化的信息及组装过程的动态录影，弥补了传统表征手段的不足. 液相电镜在微观尺度实时原位地监测高分子及其组装体系的完整动态过程的能力，也将有助于验证经典高分子物理的溶液态理论、发现新现象、提出新问题.1.2电子显微镜(EM)表征高分子及其组装体1.2.1透射电镜成像原理透射电子显微镜(TEM)自1931年问世，经过数次技术革新，已经具备了原子级分辨率，成为人们探索微观世界强有力的工具. 其结构可以分为照明系统、成像系统和观察记录系统. 图1简单总结了EM发展的里程碑事件，包括TEM，扫描电镜(SEM)、冷冻电镜(Cryo-EM)以及本文主要讨论的液相透射电镜(LP-TEM)等.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23215.F001Fig. 1Milestones of EM.TEM利用电子成像. 电子的粒子性是基于库仑相互作用的散射行为的基础，而讨论成像时需要采用波动性描述. 由量子力学可知，电子作为物质波，可以用速度和波长描述. 根据瑞利判据，显微镜的分辨极限为：d≈0.61λnsin α (1)式中，λ为入射波长，n为透镜与样品间介质的折射率，α为入射孔径角. 从公式(1)中可知，减小入射光的波长或者提高透镜与样品间介质的折射率都可以提高显微镜的分辨能力. 电子的波长在0.1 nm以下，是可见光波长的1/1000，而在TEM中电子被加速波长进一步缩短，电子所带的负电荷使其可被电磁透镜聚焦[17]从而实现分辨率可达原子级的成像，区别于中子或X射线衍射. 因此，TEM常用于纳米乃至亚纳米尺度物质结构的表征.TEM成像流程可简述如下：电子枪作为照明源发射电子束，电子束穿过样品并部分与样品发生相互作用，携带了样品的结构、组成等信息. 出射电子经物镜聚焦形成图像，再经由中间镜和投影镜逐级放大，最终被相机记录. 此外，中间镜还决定了TEM的成像模式，可实现在实空间和倒空间下成像的选择性.透射电镜图像质量主要由样品本身结构、电子剂量和加速电压决定. 随样品所包含的元素的原子序数增加，质子数也增加，电子与原子核及核外电子云之间通过库仑力相互作用增加，电子在穿过样品时发生更明显的偏转. 当加速电压增加时，弹性散射和非弹性散射程度都会下降，前者导致图像衬度降低，而后者则有助于缓解辐照分解和热致损伤等，因此需要选择合适的加速电压[18].此外，影响图像质量的因素还包括电磁透镜带来的球差、色差和像散. 像散是透镜在x和y方向上的强度不同造成的. 在聚光镜中，像散会导致椭圆形光束；在物镜中，像散则会导致图像x和y方向上的聚焦强度不同，一般可以在成像前消除. 色差是由不同速度的电子经透镜时受到透镜电流的影响不同而无法汇聚到一个焦点上导致的，通过能量过滤器也可以得到校正. 球差来自：当电子经过电磁透镜中心区域时它所受到的力小于电子经过透镜边缘时受到的力，因此同一点散射的电磁波经过电磁透镜的汇聚作用后不能交于一点. Urban等[19]通过使用多极校正装置调控电磁透镜的聚焦中心，实现了球差校正，最大程度上提高了图像质量.最后，检测器对TEM图像质量同样具有重要影响. 图像的记录最初依赖于胶片，高度自动化的图像记录随着慢扫描电荷耦合器件(CCD)相机的广泛应用而实现. CCD相机通过将电子转化为光子提高了灵敏度，但牺牲了部分空间分辨率. 近年来，可直接检测电子的电子直读相机(DDD)改进了这一缺陷[20].TEM分辨率受益于透射电子显微镜硬件的更新以及计算能力的提高. TEM助力无机纳米颗粒体系的研究已经数十年，取得了丰硕的成果. 但是，将其用于软物质的研究，尤其是液体环境中软物质微观结构的研究方兴未艾. 结合基于深度学习的图像分析算法，TEM将为我们提供对于软物质构象变化及相互作用过程更加深入详细的认识.1.2.2LP-TEM原理LP-TEM的成像原理与普通的TEM相同，区别在于样品的装载方式，即LP-TEM需要额外考虑构建可靠的液体池. LP-TEM中，液体样品严格密封于液体池并被放置于样品杆尖端，因此可搭配常规TEM设备进行表征. LP-TEM的空间分辨率取决于组成液体池的窗口材料厚度以及液层厚度. 厚度越大，用于明场成像的透射电子越少，散射电子越多，导致空间分辨率下降. LP-TEM的时间分辨率则依赖相机，相机的帧速率决定了所拍摄过程的时间尺度，从毫秒到秒级的时间分辨率涵盖了多种物理、化学过程. 最常见的两类液体池依据其使用的窗口材料的不同分为氮化硅 (SiN)液体池和石墨烯液体池. 下面将详细介绍如何引入液体池以实现对液体样品的原位成像.为保证电子枪的发射以及最大程度上减少电子的散射，TEM中必须保持高真空(1×10-5 Pa). 因此，实现LP-TEM的关键在于将液体稳定封存在真空腔中. 早在1934年，Marton[21]利用了两片铝箔包裹活体生物样品，尝试在TEM下进行研究，但受限于铝箔和液体层的厚度，当时的分辨率仅在微米量级. 1942年，Ruska等[22]在TEM样品室和电子光学器件之间设置了温和的压力梯度，使得样品室中可维持最高2×104 Pa的气压，可在稳定液体样品的同时维持其余部分的真空. 但在这样的设计结构中，液体样品的厚度难以准确控制在1 μm以下，导致空间分辨率大打折扣. 因此，问题之二便是如何得到稳定的薄层液体. 这一问题由后续设计出的液池解决[23]，这些液池不仅提供了观察窗口来同步记录样品分子的动态现象，还能降低样品电子束损伤程度. 目前2种主流液池是由微电子机械系统技术制成的SiN液池[24] (图2(a))和由两层石墨烯形成的石墨烯液池[25~27] (图2(b))，此外还有二者衍生的其他类型的液池[28~34]. 它们在窗口厚度、成像条件以及电子与液体的相互作用及其对样品分子的影响方面有所不同.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23215.F002Fig. 2Two mainstream types of liquid cells: (a) SiN liquid cell; (b) graphene liquid cell (Reprinted with permission from Ref.[36]; Copyright (2023) John Wiley & Sons, Inc.).SiN液池在纳米颗粒、组装体等的成像上有广泛应用[24]. 而有机和生物分子主要由低原子序数的元素组成，它们的电子散射能力差，信噪比通常较低，且易受电子束损伤，使用高导电和导热的石墨烯液池成像比SiN液池更有优势. 石墨烯液体池由Yuk、Park和Alivisatos在2011年发展[27]，仅由两层单原子石墨烯组成，而SiN液池的窗口材料通常为20~50 nm，相比之下石墨烯液池的窗口材料薄了1~2个数量级. 石墨烯液池更薄的窗口材料大大降低了成像背景，而其还可作为自由基清除剂[35]的功能进一步有助于延缓电子束引起的放射性化学反应和样品损伤. 当用于成像的高压电子的能量大于使得石墨烯材料中碳原子错位的临界撞击能量(knock-on energy)时，石墨烯产生缺陷，最终会导致液池破裂. 因此，使用石墨烯液池时，较低的加速能量有利于实现长时间成像. 但是低加速电压下电子与液体的相互作用体积较大，电子束与样品的相互作用更加复杂. 由Ross首创的SiN液池在可重复性和多功能性方面具有显著优势，其可以与热、光和电极整合[24].1.2.3LP-TEM的应用LP-TEM已经在无机硬材料研究的许多研究方向发挥重要作用，包括成核、生长、扩散、相变、腐蚀以及组装机制的解析[37]. 在软物质领域[38]研究上的应用虽然起步稍晚，也已经在分子聚合[39]、胶束形成[40]和超分子转化[41]等问题上提供了关键性的实验证据. LP-TEM最近刚刚开始被应用到对电子束高敏感的生物大分子结构动力学的研究中[4,36,42~51]. 本文将聚焦于EM在高分子物理及分子组装问题中的应用，从实验发展、数据分析等角度展开讨论.1.2.4电子束与液体样品的相互作用我们需要充分理解电子与液体样品的相互作用，才能控制和评估电子束对样品的影响，进行准确的图像分析.电子与液体样品主要的相互作用是电子辐解，相比于干态TEM，LP-TEM中电子与液体的相互作用方式更为丰富，机理更加复杂，液体在电子作用下发生辐射分解产生的副产物更加多样，甚至于造成样品的损伤或降解. 高分子样品相比无机纳米材料有两个重要的挑战：首先，高分子样品对电子辐解更加敏感和脆弱，需要较低电子剂量率；其次，高分子样品主要是由原子序数相对较低的元素组成的，如碳、氢和氧等，它们与电子散射作用截面小，产生的TEM图像衬度远低于原子序数较大的金属元素，因此，需要更高的临界电子剂量产生高质量可定量分析的图像质量. 基于此，LP-TEM需要在电子剂量、空间和时间分辨率以及样品寿命之间权衡利弊找到最优解.幸运的是，LP-TEM中电子束对液体及样品的影响目前已经得到了充分研究(图3). 人们把电子辐照损伤可以分为3类. 第一种是由电子-样品相互作用引起的撞击损伤或原子错位，这种损害可通过降低电子的加速电压，使能量低于能量阈值来有效避免[52]. 第二种是由电子-溶液相互作用引起的溶剂辐解. 电子束的能量转移到液相样品后，水分子分解产生初级产物，包括溶剂化电子、氢自由基、羟基自由基，以及继续反应所形成的次级产物[53]. Bau等对这一现象进行了半定量的理论研究，证明辐射分解产物在毫秒级的时间范围内达到稳定浓度，而在较高的电子剂量率下分解产物的浓度会增加[54]. 值得注意的是，纯水的辐射分解主要通过降低局部pH值、增加离子强度和形成气泡来影响成像实验，可能造成高分子降解损伤等不利影响[55]. 第三种是电子与LP-TEM液体池窗口材料相互作用引起的电荷积累，引起局域加热和分解导致的碳氢化合物的污染. 实验上发现电荷在不良导体的窗口材料上积累，导致样品中颗粒由于静电排斥而运动[56]以及气泡与聚醋酸乙烯(PVAc)基底之间的静电吸引[33]. 对于SiN液池而言，较大的液体体积、液体可流动的结构设计以及液体相对较高的比热容都有助于削弱电子束带来的加热效应. 相比之下，由于石墨烯具有优异的热导率和电导率[57]，电荷积累效应和加热效应在石墨烯液池中都可被忽略. 但无论SiN液池还是石墨烯液池，对LP-TEM中碳氢化合物污染的形成及预防机制仍有待进一步研究[58].10.11777/j.issn1000-3304.2023.23215.F003Fig. 3The electron beam effect in LP-TEM.在充分理解电子束效应的基础上，可以尝试控制电子束的影响. 2018年，Granick等[59]使用LP-TEM对单个高分子链表征时将溶剂由普通水换成氘水，发现使用氘水的效果在不同成像条件下都优于在普通水中添加自由基清除剂(甘油、氯化钠、没食子酸正丙酯等)，将液池中的有机大分子的成像寿命增加2~5倍，并且能将辐射分解引起的气泡出现的时间延迟长达10倍. 2021年，Gianneschi等研究了聚乙二醇在存在敏化金纳米颗粒或自由基清除剂异丙醇的水溶液中的辐解环境，证实了聚乙二醇可以显著减轻水中聚合物的辐解损伤，而金纳米颗粒则显著增强了损伤[60]. 更详细的电子束与液体的相互作用可参考Egerton[52]、de Jonge[61]、Gianneschi[62]、Patterson[63]等的综述.1.2.5图像处理由于液层和窗口材料的存在，加之成像过程中使用了低电子剂量率以最大程度降低电子束对样品的影响，LP-TEM时间序列图像单帧的信噪比(SNR ≈ 2~6)[64]通常低于干燥样品的EM图像，这给分析带来了挑战. 但得益于近年来机器学习和深度学习的飞速发展，计算机进行图像处理的技术日益丰富和完善，对这类数据的分析已经成为可能[65]. 2020年，Chen等[65]将机器学习的方法应用到了对不同形貌的金纳米颗粒的LP-TEM数据分析中，使用U-Net神经网络从高背景噪声的图像中预测纳米颗粒的位置，并对形状边界进行图像分割，结合胶体物理中较为完善的单颗粒分析方法[66]定量地揭示了胶体颗粒纳米尺度的动态信息，例如纳米棱镜的各向异性相互作用、纳米棒的曲率依赖和分阶段蚀刻，以及凹面纳米立方体的一阶链式组装的动力学规律. 2022年，Chen等[67]进一步将机器学习与电子断层扫描、EM、AFM等结合，研究了用于商业分子分离的聚酰胺膜的三维形貌，解析了其皱缩形式的发生机制. 三维断层图显示，皱褶的空间排列随着单体浓度的增加而变化，其形式与图灵不稳定性相一致，从而在聚合物薄膜的合成和性能之间建立了定量的联系，该方法也可以推广到更多的纳米材料体系. 2023年，Wang等[64]应用U-Net和UNet++神经网络对一系列单分子的LP-EM图像进行图像分割，包括聚合物和DNA，并将结果与传统方法进行比较，实现了低信噪比图像 (1.5SNR5)的全自动化高通量分析，同时实现了更高的图像分割精度，精确提取动态录影中的瞬时动态变化(1 nm，3碱基对)，从而提取单分子局部构象变化来捕捉罕见的中间态，有效避免了传统图像分析方法中可能存在的主观误差. 该方法为使用LP-TEM定量分析生物大分子相互作用途径及动力学提供了强大的工具(图4).10.11777/j.issn1000-3304.2023.23215.F004Fig. 4An image sequence captured interaction processes and intermediate states of three molecules. Comparisons of results obtained from conventional threshold methods, UNet++, and U-Net to the ground truth. Scale bar: 10 nm. (Reprinted with permission from Ref.[64]; Copyright (2022) The Royal Society of Chemistry).1.2.6其他EM方法经典的电子成像方法，包括TEM和SEM，应用于表征干燥的高分子或组装体样品[68~70]，具有分辨率高、制样简单等优势. Cryo-EM也常用于高分子和组装体的表征[71]，但由于分子被冰冻至玻璃态，无法获得构象转变的路径和动态信息. 更重要的是，由于高分子样品大多需要溶解在有机溶剂中，所以，即使Cryo-EM已经成为一种非常可靠而强大的表征手段，但多针对生物学中的水相样品，在本质上较难与有机相样品相适应[72].此外，三维重构是理解高分子与组装体结构与性能之间关系的重要手段. 将LP-TEM与断层扫描技术相结合，从而突破TEM图像二维投影的限制，对所观察的液体样品进行三维重构，对分子在三维空间上的运动和相互作用进行表征，获得更加丰富和多样的结构信息. 2019年，Kelly等[73]介绍了使用液池电子断层扫描技术对液体中的材料进行三维成像. 他们观察和量化溶液中的宿主-病原体相互作用，研究了噬菌体和其宿主细菌的交战规则，揭示了感染性单元的结构特征.2高分子与组装体的LP-TEM成像相比于光谱、散射和衍射技术，电子显微技术的优势在于能够直观地展示微观尺度结构. 在表征干燥状态的样品结构的基础上，如能实现液体状态样品的表征，就可以了解样品构象态之间相互转化的动态过程与中间态的形成过程. 依据研究对象与所关注的科学问题的空间尺度的不同，我们将从单分子、单分子反应、组装体与组装行为三个部分分别介绍用于表征高分子与组装体体系的部分LP-TEM相关工作.2.1单分子对单链聚合物的研究能揭示结构相同的大分子之间异质性动力学过程[36]. Schroeder等[74]讨论了使用单分子方法对合成高分子的研究. 相比于胶束、囊泡等较大的组装体，高分子单链成像需要足够高的空间分辨率，这使得石墨烯液体池更有优势. 2017年，Kandula、Wang和Granick等[75]采用改进的石墨烯样品池——裸石墨烯和附有石墨烯的载网，对单个高分子链进行了表征. 高分子链处于受限的环境，其与石墨烯表面的相互作用导致分子运动速度较慢，可以以0.3 s/帧的速度捕捉到聚合物在液池中长达100 s的连续变化. 定量分析揭示了单个聚合物分子的构象变化，以及其纳米尺度吸附-解吸、表面作用诱导的单链扩散行为与微观尺度荧光成像的结果基本一致[76]，也佐证了该实验的可靠性. 此外，随着辐照时间增长，他们也发现涉及断链和链重组的辐射损伤模式(图5(a)和5(b)).10.11777/j.issn1000-3304.2023.23215.F005Fig. 5(a, b) LP-TEM images of a flexible polymer, polystyrene sulfonate (PSS), in 0.2 mol/L NaCl. Imaging condition: 22 e-·Å-2·s-1 (Reprinted with permission from Ref.[75]; Copyright (2017) John Wiley & Sons, Inc.). (a) Image of a GLC containing PSS; (b) Time-lapsed conformational changes and the quantification using pixel count and pixel span. (c, d) LP-TEM images of a rigid polymer PTD-MuG2. Imaging condition: 400 e-·Å-2·s-1, 200 kV (Reprinted with permission from Ref.[77]; Copyright (2022) John Wiley & Sons, Inc.). (c) Conformational changes shown in different number of loops. (d) Time-lapsed change of loop states quantified.2021年，Park等采用同样的石墨烯液封方法对半刚性的第二代树枝化聚合物，由聚(内-三环[4.2.2.0]癸-3,9-二烯) (PTD)骨架和Müllen树枝状结构组成的PTD-MuG2进行了单分子成像[77]. 可解析得到高分子链具有单环、双环乃至多环的不同构象，包括不同构象存在的时间以及相互转化的过程. 在此基础上，他们还观察到了单链在气-液界面的断裂过程：在气泡接近之前，链的两端被钉在气-液界面上；随着界面的移动，链被拉伸并在中间断开. 除分子链与气-液界面的相互作用外，研究发现单链动力学受到其结构中芳香环与基底石墨烯之间范德华相互作用的影响. 实验数据获取的刚性聚合物链动力学与分子动力学模拟结果一致，表明在合适的电子剂量下，成像分子的结构依然完整(图5(c)和5(d)).2.2单分子反应与观察单分子的形貌、大小、构象转化相比，观察单分子间的反应更为困难. 一是要区分反应物和产物以及中间态，二是由于分子并非原位混合，而可能先于成像发生相互作用，大量分子已经完成反应，因此捕获反应过程的概率大大降低. 对此，Wang和Granick等[78]提出需使用已知初始和最终状态的分子，因为在缺乏组成信息时只能通过形状和大小来判断分子的种类. 研究分子间的反应需要大量的高质量数据用以补偿其固有的低概率捕捉操作，同时还需要可靠有效的识别方法.2020年，Wang和Granick等[4]实时观察到单链DNA分子在固体表面附近组装形成双链螺旋结构，揭示了双链杂交路径以及中间态，此外还对比了相同长度但不同碱基对微结构(随机、块状和回文结构)的分子. 在DNA杂交过程中，观察到了杂交伴随着增强的平移运动和扭转诱导的分子旋转，为化学反应在分子层面的能量传导机制提出了新问题. 在3个单链DNA相遇过程中，他们观察到了错误修正过程，复现了在双链杂交过程中已发现及普遍存在的瞬态环状结构. 在多个单链分子的竞争结合中观察到瞬态熔化和其他失败的相遇(图6(a)和6(b)). 在此基础上，2022年，Wang和Granick等[78]报告了由2种酶(限制性内切酶BgI1和DNA连接酶)催化的DNA聚合反应：这个不可逆聚合过程包含了DNA引物(15 bp)和单体(5 bp)的黏性端识别和连接步骤以及引物原始黏性端再生步骤. 理想情况下，反应初期的约5~7 nm长的物体(引物+单体，20 bp)将逐渐成长为几十纳米长的棒状物，过程中存在与球状物(酶)的瞬时结合. 事实上观察到了单链的延伸过程，从一个小物体开始，直径为5 nm，最后成长为一个40 nm的杆. 在这之间，观察到了丰富的中间结构，如圆形和波纹形状. 不过，对这些中间结构的深入理解仍面临挑战，例如，DNA如何以及为何采用一种在横截面上明显是圆形的形状，然后断成波纹，特别是当产物DNA长度仍然短于持久长度，理论上应该维持一个刚性的棒状结构 (图6(c)和6(d)).10.11777/j.issn1000-3304.2023.23215.F006Fig. 6(a, b) Schematic diagrams of time-dependent conformations (top row), base-pair alignment (second row), actual images (third row), and binarized images for better visual contrast (bottom row). Imaging condition: 2‍‒‍5 e-·Å-2·s-1, 80 kV) (Reprinted with permission from Ref.[4]; Copyright (2020) National Academy of Science). (a) Middle-contact zipper-up mechanism. Neighboring complementary single strands of random sequence meet and hybridize. Arrows in frames at 11 and 14 s indicate rotations in opposite directions. (b) Defect annealing mechanism. Neighboring complementary single strands of hairpin sequence meet and hybridize. The red circles at 0 and 17 s highlight individual molecules. Arrows in frames at 117, 144, and 158 s indicate persistent clockwise rotations as hybridization proceeds. Yellow double arrows at 34 s highlight the formation of transient intra-hairpin states. Arrows in frame 27 s indicate rotations when a hairpin forms. (c) Schematic illustration of the mechanism of polymerization by an enzyme. Red denotes the primer and blue the monomer. (d) Representative intermediates for DNA polymerization. The yellow arrows highlight enzymes. In the accompanying schematic sketches, red denotes the polymer, and yellow spheres indicate the enzymes ligase and Bgl1. (c, d) Images acquired at 10‍‒‍20 e-·Å-2·s-1 (120/80 kV) (Reprinted with permission from Ref.[78]; Copyright (2022) American Chemical Society).2.3组装体与组装行为高分子的组装方式直接决定了材料的结构和性能. 因此，可以通过合理的组装方式，根据需求实现形貌、力热电光学性能等方面的调控，指导新材料的设计和合成. 这类研究仍然面临许多挑战，分子尺度组装机制缺乏直观表征是其中之一. 使用LP-TEM可以实时原位监测组装体的形成，揭示机制和最有效路径，包括多尺度组装过程以及分子组装体与宏观材料性能之间的关系等.由于成像组装体通常在几十纳米尺寸，所需空间分辨率相比研究单链时低，SiN液池被广泛应用到相关研究上，其中Gianneschi课题组发表了许多对脂质体、胶束、囊泡等组装体的研究. 2014年，他们对含铂胶束颗粒的运动行为进行了追踪和分析[79]. 由于SiN窗口材料对胶束的吸附，胶束在液池中的运动速度远低于体相溶液. 同时，多个胶束颗粒的运动展现出协同性，这可能是由于SiN液池的导电性较差，在电子束的照射下引起了胶束颗粒、液体及液池的电荷积累. 2017年，他们直接观察溶液中由两亲性嵌段共聚物(phenyl-b-peptide-co-hydroxyl)形成的球状胶束以2种方式向双连续结构演变：一种是向球状胶束添加单体；另一种是通过球状胶束间的碰撞和融合进行. 通过对胶束扩散速度、生长速度等的定量分析，结合相关的计算机模拟，实验表征了水中两亲聚合物胶束的扩散行为和形态转变过程，解释了其中复杂的非布朗运动行为和机制，并发现了胶束的快速偏转运动、长时间的相互作用和分离[40] (图7(a)). 2021年，他们对二苯基丙氨酸纳米管的生长过程与组装动力学进行了原位观测. 该工作进一步衡量了电子束的影响，证实组装体在低电子剂量率(~0.5 e-·Å-2·s-1)下能够保持完好，在高电子剂量率(~100 e-·Å-2·s-1)下聚集，并测量了自由基捕获剂延缓损伤的定量关系[80]. 2021年的另一篇工作中，他们选取具有热响应性的嵌段聚合物作为研究体系，使用可变温液池透射电子显微镜(VT-LCTEM)和变温小角X射线散射(VT-SAXS)实现了对热响应性聚(2-(2-甲氧基乙氧基)甲基丙烯酸乙酯(PDEGMA)嵌段共聚物的热致相变过程的实时观测. 在65 ℃下，二嵌段共聚物形成囊泡结构. 在具有两亲性的三嵌段共聚物体系中，随着温度升高可以观察到组装体由小到大的转变. 结合VT-SAXS实验结果，作者推测在高于最低共溶温度时，位于胶束内核心区域的疏水链段聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(PHPMA)会与PDEGMA链段发生微相分离. 这一假设得到了VT-SAXS实验的支持，揭示了热响应聚合物在溶液态发生热致相变的微观机理[72].10.11777/j.issn1000-3304.2023.23215.F007Fig. 7(a) Left: phenyl-b-peptide-co-hydroxyl polymer micelle-micelle fusion event captured by LP-TEM. Right: Micelle projection-area plot over the duration of the LP-TEM video observation. Imaging condition: 1‍‒‍14 e-·Å-2·s-1, 200 kV (Reprinted with permission from Ref.[40]; Copyright (2017) American Chemical Society). (b) Polymerization-induced self-assembly of PDEGMA. Within the electron beam irradiated region of the liquid cell, diblock copolymers were produced, self-assembled, yielding a targeted spherical micellar phase. Imaging condition: 0.45 e-·Å-2·s-1, 200 kV (Reprinted with permission from Ref.[39]; Copyright (2018) American Chemical Society). (c) (Top row) Nucleation and evolution of PolyGMA-b-PolyHMPA block copolymer micelles. (Bottom row) Time-lapse sequential TEM images were taken during an in situ graphene LP-TEM experiment of an aqueous solution of HPMA and PolyGMA forming PolyGMA-b-PolyHMPA block copolymer micelles. The electron beam continuously irradiates the solution. Imaging condition: 1.2 e-·Å-2·s-1, 200 kV (Reprinted with permission from Ref.[85]; Copyright (2023) American Chemical Society).对分子组装的原位调控主要分为两类：一是利用入射电子引发聚合反应，随着聚合反应的进行，具有两亲性的嵌段聚合物发生组装，形成胶束或囊泡结构；二是利用控温样品杆对具有热响应性的聚合物进行温度调控. 2018年Gianneschi等[39]观察了电子束诱导的两亲嵌段共聚物聚合反应，在电子束照射区域内，电子束引发了聚合反应，聚合物生长并促进了自组装过程逐渐形成胶束 (图7(b)). 2021年，他们通过加热样品池引发可逆加成-断裂链转移聚合反应，原位形成了两亲嵌段共聚物的组装体. 在加热50 min后，直径120~250 nm的球状纳米颗粒开始出现，且数量逐渐增加. 聚合物组装所成胶束的理论直径一般不超过100 nm，因此这些直径250 nm的颗粒被认为是囊泡或双连续胶束. 与干样TEM和DLS等非原位表征手段结论一致[81].嵌段共聚物以及相关的组装是热门的研究方向[82]. 研究人员用LP-TEM研究了嵌段共聚物形成胶束或囊泡、封装纳米颗粒、破碎、形成膜、组装等过程的动力学. 2019年，Mirsaidov等[83]捕捉到通过两亲性嵌段共聚物(EO100-PO65-EO100)形成胶束的过程和胶束对水溶液中金纳米粒子的封装过程. 观察显示，EO100-PO65-EO100聚集并重新排列，形成一个具有疏水和刚性核心的胶束，其周围是延伸到溶液中的亲水嵌段的冠状部分. 这些胶束能拮抗凝聚，熟化时不发生合并. 结果还表明，疏水纳米颗粒的封装是一个自我限制的过程，它是通过逐步吸附嵌段共聚物而发生的；当纳米颗粒被吸附的共聚物完全覆盖时，纳米颗粒周围聚合物外壳的增长就会停止. 这些现象对设计生物相容性软材料有所启示.2019年，通过将LP-TEM、自洽场计算和吉布斯自由能计算的结合，Patterson等[84]探测了一个模型嵌段共聚物聚氧化乙烯-聚己内酯嵌段共聚物系统(PEO-b-PCL)组装成囊状结构的过程. 液滴作为自下而上形成球形胶束的前体，随后演变成囊泡，揭示液-液相分离形成囊泡的新机制. 相分离影响囊泡尺寸和膜的厚度，以及自组装过程中动能陷阱的启动. 该工作描述了两亲自组装是如何在液-液相分离之前进行的，证明了在广泛的两亲系统中自下而上的自组装过程中相分离的存在. 2021年，他们使用SiN液池，研究了嵌段共聚物形成支撑双层膜的过程. 通过对于动态录影的分析，总结出2种形成途径，它们涉及液滴或囊泡作为中间产物而逐渐发展成支撑双层结构. 对囊泡扩散速率定量表明，液滴扩散机制形成的双层相比囊泡扩散机制具有更少的缺陷[41].2023年，Shahbazian-Yassar等[85]观察了聚合诱导自组装过程中单个纳米级胶束的成核和演变. 实验利用聚(甘油甲基丙烯酸酯) (PolyGMA)-硫代氨基酸大分子链转移剂的均裂产生自由基，引发甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)聚合. HPMA的链生长以及所得嵌段共聚物在溶液中的不稳定性进一步触发了纳米级聚合物自组装的形成(图7(c)).尽管生物大分子组装体更易受电子束的影响，对于磷脂组装体和多肽组装体的LP-TEM实验揭示了符合预期的新现象.2018年，Alloyeau等[86]描述了生理介质中细胞外囊泡(EVs)的形态和动态行为. EVs有望成为生物活性治疗剂和诊断各种疾病的生物标志物，正需要用纳米级成像方法来描述这些复杂和异质的软材料在其原始湿环境中的特征. 结果表明，EVs的大小形态对渗透压很敏感，渗透压倾向于将其球形转变为椭圆体、气孔细胞或盘状细胞的形态. 在液池中，由于金纳米粒子和液池窗口之间的强烈相互作用，EVs表现出一种亚扩散运动. 本研究还实现了对EVs聚集和融合过程的高分辨原位监测，体现了LP-TEM在细胞膜动力学研究中的重要价值.2022年，Wang和Granick等[78]观察了磷脂胶束分子(bicelle)的生长和融合过程. 观察到预期的融合过程：3个bicelle (∼6 nm，28.6 s)融合成了1个大bicelle (∼15 nm，84.5 s). 2个融合过程相继发生，如图8(a)和8(b)所示. 融合过程迅速，在3 s内完成：第一次融合发生在54.6~57.2 s之间，形成∼10 nm的bicelle；第二次融合发生在83.2~84.5 s之间. 不同于系综平均的测量手段，单独观察脂质体生长融合的能力使实验能够直接与模拟进行比较，正如以前对尺寸较大的50~100 nm的嵌段共聚物胶束的研究[40,84]所建议的那样. 2022年，Lu和Wang等[87]研究了由蛋白质介导的两亲硫辛酸(LPA)衍生单体在室温下的聚集诱导聚合反应，从而实现从蛋白质半胱氨酸残基上原位生长多二硫化物，有助于蛋白质功能的瞬时调节和按需恢复. 作为直接证据，LP-TEM证实了单甲醚七缩乙二醇硫辛酸酯(LPA-OEG7)在H2O中存在液滴状纳米颗粒(聚集体或胶束)，与DLS实验结果吻合. 溶液中聚集体呈现出相对流动的形态，易被剪切应力延展甚至完全破坏. 结合临界胶束浓度、动力学等测定，进一步验证了聚集诱导聚合机理的猜想(图8(c)).10.11777/j.issn1000-3304.2023.23215.F008Fig. 8(a, b) Coalescence of lipid assemblies. Imaging condition: 10‍‒‍20 e-·Å-2·s-1, 120/80 kV (Reprinted with permission from Ref.[78]; Copyright (2017) American Chemical Society). (a) As-taken LP-TEM image of a 350 nm wide graphene liquid cell containing assemblies of dimyristoylphosphatidylcholine and dihexanoylphosphatidylcholine. (b) Representative images (top) with a false color filter to enhance visual contrast (bottom) before and after coalescence. t=0 is defined as the moment the electron beam is turned on. (c) Representative LP-TEM images of 100 mmol·L-1 LPA-OEG7 in H2O, acquired at 80 kV (Reprinted with permission from Ref.[87]; Copyright (2022) American Chemical Society).2022年，Ghandehari等[88]展示了使用控温LP-TEM来实时评估弹性蛋白样多肽(ELPs)及其自组装纳米结构的溶液和界面行为，成像温度范围包括了其固有的低临界溶液温度，因此可根据溶解状态区分单个聚合物和组装体. 重组聚合物被证明可以从缓冲溶液中吸附到SiN芯片窗口，并以温度依赖的方式解吸. 丝-弹性蛋白类嵌段共聚物(SELPs)(由丝和弹性蛋白的重复肽图案组成)在热行为上与ELPs不同. 虽然2种聚合物都被证明可以聚集，但只有SELPs在加热时形成了坚固的淀粉样纤维.同样，LP-TEM也可以解析解组装过程. 2020年，Lodge等[89]报告了使用高温LP-TEM直接观察三种分子量的1,2-聚丁二烯-嵌段聚环氧乙烷胶束在离子液体1-乙基-3-甲基咪唑鎓双(三氟甲基磺酰)亚胺中的破碎情况，解析了破碎演变全过程.在加热到170 ℃时，作者观察到一连串的形态转变，从球状胶束到长椭圆体，到“花生”形状，到双球形腔胶束，最后破碎成两个更小的胶束，其中双球形腔胶束被推测为过渡状态 (图9(a)).10.11777/j.issn1000-3304.2023.23215.F009Fig. 9(a) LP-TEM imaging of the fragmentation of three molecular weight 1,2-polybutadiene-block poly(ethylene oxide) micelles in the ionic liquid 1-ethyl-3-methylimidazolium bis(trifluoromethyl sulfonyl)imide at 170 ℃. Imaging condition: 9.8‍‒‍11.3 e-·Å-2·s-1, 200 kV (Reprinted with permission from Ref.[89]; Copyright (2022) American Chemical Society). (b) (Top row) LP-TEM images for the dynamic disaggregate process of polymer IIDDT19 in a liquid pocket at the bubble/liquid interface, mimicking the condition for solution processing of conjugated polymer. The red marks identify the image-tracking results. (Bottom row) The corresponding binarized images were obtained from threshold intensity. Imaging condition: 14.5 e-·Å-2·s-1, 80 kV (Reprinted with permission from Ref.[90]; Copyright (2022) Springer Nature).2023年，Pei和Wang等[90]结合LP-TEM、传统EM、AFM以及紫外吸收光谱等多种表征手段探究了基于异靛蓝的共轭聚合物从单链到聚集体再到薄膜的演变过程. 借助LP-TEM，结合变温吸收光谱，该工作直接可视化了聚集体(IIDDT19)解聚的动态过程，系统地研究了链长对共轭体系溶液态聚集和成膜动力学的影响. 刚性短链的高结晶度可能主要源于成膜过程中聚集体的有序生长，相比之下，长而柔性的聚合物链在成膜过程中连接多个纤维状聚集体，在溶液中形成组装网络，进而构建有效的电荷传输网络. 这为优化基于共轭聚合物的电子器件提供了通用策略(图9(b)).3总结与展望EM已被广泛应用于表征干态高分子及组装体样品的形貌、晶态结构、机械性质、共混相容性、自组装行为等，助力高分子与组装体的研究. LP-TEM保持了EM的空间分辨率，实现了百毫秒级的实时动态录影. 针对单链高分子或高分子组装体的定性分析已经揭示了被系综实验所掩蔽的单分子异质性，发展更高精度的结构和动态成像和定量方法将大有裨益. 分子动态录影将提供丰富的动力学信息，与分子动力学模拟相互印证和实现互补.首先，液池应该兼容更多样的样品，实现多模态成像方法的集成. 下一代的液池应该是：(1)多功能的. 将集成变温、电场、光纤和溶液原位混合其一或其中多种功能. 其中，温度控制与LP-TEM的结合具有广泛的应用前景并已经进行了初步的尝试. 例如，Gianneschi等[72]使用变温LP-TEM研究了热相应聚合物的动态行为. 此外，我们还有望使用变温LP-TEM研究温度调控的液-液相分离过程. 相分离的过程无论是在工业生产还是在生命活动中都具有重要的研究价值，它既是细胞形成无膜细胞器的物理化学基础，又广泛存在于调味品、化妆品的生产中，具有很强的实用性. 研究和理解相分离的形成过程有利于我们有效地控制和利用相关过程实现进行科学研究和生产实践. (2)高效的. 高通量样品的高质量成像；(3)成本低的. 针对这些愿景，研究者们已经做了初步探索. 例如：石墨烯液池与SiN液池结合，同时了实现液体原位混合和高分辨成像[91]；采用电纺技术制备PVAc高分子液池等[33]. 这些方法各有利弊，尚未兼备理想液池的所有特征. 此外，液池设计上还需要深入考虑外部因素的影响，包括温度变化、压力变化、空间限制以及最重要的电子束与样品的相互作用，以避免成像过程中可能的干扰.第二，进一步理解液池中窗口材料、样品分子和液体与电子之间的相互作用. 针对电子束导致的辐射分解问题，可通过引入对电子束敏感程度更高的“牺牲分子”以保护样品分子；针对电子束和液池表面与样品分子的相互作用对分子热力学本征构象分布和转化动力学的影响问题，需要进行系统深入的研究.第三，LP-TEM另一个重要的发展方向是高效、准确地从时间序列的图像信息中挖掘分子的动力学信息，并建立规范化、流程化以及批量化的数据分析流程. 结合机器学习、深度学习实现对于低衬度图像的信号增强、物体定位、二值化、分割、识别及运动跟踪. 电子剂量和图像衬度正相关但和样品的成像时间反相关、因此实现对模糊图像及不规则图像进行降噪及图像切割也将帮助提高LP-TEM方法的时间分辨率，对研究瞬态过程至关重要. 其在高分子物理问题上应用前景广阔，例如，通过对单分子动态录影的逐帧分析可以捕捉生物大分子构象变化及相互作用过程的短寿命中间态等. 最后，LP-TEM获得的数据集均为生物分子的二维投影，无法获得更多关于三维空间中的结构信息. 溶液中的生物大分子存在旋转运动，导致其在TEM图像中呈现从不同角度获得的投影，因此已有人利用LP-TEM数据对三维重构进行了初步探索. Battaglia等[92]利用这一特点，以100 ms的时间分辨率获得了铁蛋白10 s内的LP-TEM数据. 动态录影被分为5段，仅根据每段录影的10帧图像进行三维重构，获得了约0.55 nm的分辨率，且可以观察到蛋白质结构随时间的演变. 这种思路既保留了LP-TEM所能提供的时间分辨信息，又可以提取二维投影中隐藏的三维空间信息.LP-TEM已经发展为一种可以实时、原位观测软物质体系动态变化的有力工具. 目前，使用对高分子的研究主要集中于胶束等聚集体，对单分子的研究刚刚起步，发展单分子EM成像技术可以为解析高分子(包括生物大分子)化学反应机制和动力学提供新的研究手段. 例如：通过对构象态的统计分析可以获得不同构象态的能级分布. 针对含有无序区的蛋白分子相互作用往往只能由分子动力学模拟研究实现，例如：钙调蛋白招募三百多个结合靶标[93]，单分子LP-TEM成像可以实现实验验证. 长期以来，高分子单链异质性产生机制，以及其对高分子反应产生的影响一直是高分子科学的基础问题，单分子成像实验可以帮助我们更好地理解这些非平衡态过程. 借助LP-TEM兼具时空分辨率且无需标记的优势，单链高分子链增长、断裂及构象变化可以被实时记录，通过对此类单分子录影的分析可以解析高分子聚合及降解反应区别于小分子反应的机制和动力学特征，帮助我们深入理解高分子聚合机理及高分子材料构效关系.在使用单分子LP-TEM对高分子体系研究的同时，结合联用核磁、荧光等传统的系综或单分子表征手段，可以获得更为全面、多元的信息，在分子水平上揭示从单分子到系综，再到在外场影响下的非平衡过程等不同复杂程度的体系中基础的物理、化学过程，以便实现对于高分子合成、降解及性能调控的分子级精确调控. 例如：Wang和Pemberton等[94]将FRET与表面敏感的全内反射(TIRFM)结合发展了FRET-TIRFM方法，测量了层流条件下与聚合物表面垂直的流场对聚合物滑移几十纳米，且随层流流速、聚合物密度以及流体对聚合物的溶解性而变化，进一步揭示了纳米尺度高分子在流体中的动态界面结构和其中的复杂协同效应[95,96].原位液体流动的LP-TEM实验有望实现对聚合物表面与溶液界面结构亚纳米尺度的实时原位成像及分析，更为直观地观察固液界面乃至液液界面的结构和性质，研究相分离体系中高分子及其组装体高度动态的宏观变化过程，揭示液-液相分离相关的生物体系(细胞中形成的各种生物分子凝聚体如应激颗粒[97]、通过相分离形成的无膜细胞内隔室[98]等)以及疾病产生机制(异常的液液相分离可能导致蛋白质错误折叠和聚集[97]等)，有助于理解其驱动力、转变机制、分子功能等，揭示热敏聚合物相变引发形态学和流变学的变化等等，对物质分离、胶体研究、物质运输、生物技术以及非平衡状态下流体的研究提供更深入的理解.