纳米凝胶颗粒是由高分子链交联形成的三维网络颗粒. 在不同溶剂中，凝胶颗粒会随着溶剂质量和交联密度的不同发生不同程度的溶胀，而达到几十纳米到100 nm的尺寸. 当尺寸达到微米级别时，通常被称为微凝胶[1,2]. 近年来，微纳凝胶在药物输送、组织工程和生物医药植入等领域的应用日益受到关注[3~6].壳聚糖基的微纳凝胶由于其生物相容性、无毒性、稳定性和生物可降解性，在生物医药领域具有广泛的应用前景[7~9]. 壳聚糖微纳凝胶通常会由多官能团试剂如三聚磷酸钠、戊二醛、二异氰酸酯和环氧化合物交联而成[10~12]. 然而上述这些交联剂均具有一定的细胞毒性，降低了交联得到的壳聚糖纳米凝胶的生物相容性.使用天然交联剂京尼平交联壳聚糖可解决生物相容性的问题[13,14]. 京尼平是由从栀子花中提取出来的京尼平苷水解得到的. 除了可以交联壳聚糖，京尼平还具有一定药理性能. 传统中医会将其应用在缓解Ⅱ型糖尿病、头痛、炎症以及肝功能紊乱等方面[12,15,16]. 京尼平在食品方面也有所应用，其在有氧气加热的条件下与仲胺基团反应呈蓝色，可作为天然的食品色素添加剂[17,18]. 由京尼平交联壳聚糖得到的纳米凝胶还保留了壳聚糖凝胶原有的可降解等特性[19~23]. 除此之外，近期Hu等发现，由于京尼平具有一定的疏水性在与壳聚糖交联形成纳米凝胶后，可以用来制备食品级的高内相Pickering乳化剂，乳化程度高达90%[24].京尼平交联壳聚糖的化学反应(图1(a))简单可控，每一个京尼平分子可以和两个相同链上或不同链上的氨基发生链内或链间交联反应，该反应在37 ℃下即可发生，且反应条件比较温和，当反应物稀释到低温溶剂中时，交联反应几乎停止，因此很容易通过升降温将交联反应终止在不同的阶段. 因此该体系可作为研究基于生物大分子微纳凝胶交联动力学的模型体系[25].10.11777/j.issn1000-3304.2023.23253.F001Fig. 1(a) Crosslinking reaction of chitosan using genipin as a crosslinker. Schematic illustration of (b) the precursor solution, (c) the solution of nanogels, and (d) the Pickering high internal phase emulsions stabilized by the nanogels. The images of the corresponding samples are shown as inset in panels (b) and (c) respectively.近期Zhao等发展了通过非对称流场流分离(AF4)与多检测器联用的方法来表征不同交联阶段的纳米凝胶颗粒的尺寸和结构演变[26]. 他们选择重均分子量Mw=192 kg/mol的壳聚糖链为预聚物(precursor)，配制远低于重叠浓度(~0.1 wt%)的无色透明的水溶液(如图1(b)所示)，壳聚糖溶液可通过京尼平交联反应生成纳米凝胶颗粒，交联后的溶液变成蓝灰色(如图1(c)所示). 为了分离不同尺寸的凝胶，他们使用了非对称流场流分离技术. 该技术相较于常规的体积排除色谱技术的最明显的优势是不使用固定相，因此不会受到因高分子与色谱填料之间发生相互作用导致的吸附等效应的影响，适合于研究具有极性或者含有离子的生物大分子体系[27~29]. 将非对称流场流分离设备与示差折光检测器(RI)、多角度激光光散射(MALLS)、紫外光谱(UV)联用，可以分别测得不同级分高分子的含量、分子量、尺寸和反应程度(即交联程度). 同时，根据不同交联时间所得样品的场流分离级分的链结构差异可以分析出交联反应的动力学特征. 他们发现京尼平交联壳聚糖体系一个突出的特点就是随着交联的进行，高分子上的电荷数会随着氨基的交联反应而减少，因此形成的溶胶或者凝胶的疏水性会增加，进而导致复杂的链尺寸和分子量分布.此外，Zhao等[26]还发现有别于传统合成高分子形成的纳米凝胶，京尼平交联壳聚糖反应后形成的凝胶颗粒的分子量虽跨越了3个数量级(从105~108 g/mol)，但是其尺寸的分布却相对更均匀：即纳米凝胶分子量的急剧增加并未引起尺寸的显著增大，90 wt%以上的凝胶颗粒的尺寸低于40 nm. 为了解释该现象，他们提出了纳米凝胶尺寸的控制机制：一方面，由于壳聚糖的高分子链的具有较高的刚性，Kuhn链段的长度lK为20 nm，因此当尺寸大于20 nm的预聚物发生链内交联时，高分子链的折叠会受到链弯曲势能的限制，使得纳米凝胶颗粒的尺寸下限大于20 nm. 另一方面，在链间交联的作用下，纳米颗粒的分子量会不断增加，大尺寸的纳米颗粒受到的链弯曲势能的影响较小，可以发生链内的交联. 在链内和链间交联的共同作用下，更大尺寸的凝胶链上的电荷密度会降低，这导致了链的疏水性和柔顺性的增加，因此得到的纳米凝胶更容易发生体积塌缩，使得纳米凝胶尺寸增幅远小于分子量的增幅，最终导致跨越3个数量级的分子量的纳米凝胶颗粒具有近似的尺度，其内部的平均浓度从接近于预聚物溶液的浓度(~0.1 wt%)增加到接近于壳聚糖本体的浓度(~45 wt%).我们认为，上述机制可能具有一定的普适性. 据此，本工作进一步拓展和深化了京尼平交联壳聚糖的动力学机制的研究，从三个方面展开：一是研究不同的预聚物链分子量对于最终形成的纳米凝胶颗粒的尺寸分布的影响；二是研究不同交联剂含量对于交联程度和形成的纳米凝胶颗粒的尺寸分布的影响；三是探索了上述制备的纳米凝胶颗粒在Pickering乳液中的应用(如图1(d)所示).1实验部分1.1原料在此前的工作中，Liu等研究了一系列的商业化的脱乙酰胺度~95%的壳聚糖10个样品，样品均购于德国Heppe Medical Chitosan (HMC+)公司[30,31]. 在本文中我们分别选取分子量较低、中等和最高的CS95-20、CS95-200、CS95-3000样品来研究，其中95代表壳聚糖的脱乙酰度约为95%，20，200，3000分别代表在20 ℃下，1 wt%壳聚糖溶液的黏度(单位mPa·s)数值. 醋酸(CH3COOH，分析纯)和醋酸铵(CH3COONH4，分析纯)购于美国Sigma-Aldrich公司，京尼平(纯度98%)购于中国江西临川之信生物科技有限公司.1.2非对称流场流分离与多角激光光散射联用实验(AF4-MALLS)AF4实验使用Wyatt公司的Eclipse DualTec系统(Dernbach，德国)，该系统包括153 mm长，350 μm厚的梯形流道和截留分子量为10 kg/mol的再生纤维素半透膜. 该系统配置的检测器包括DAWN HELEOS II型18角度激光光散射检测器、DynaPro Nanostar动态光散射检测器(DLS)、Optilab T-Rex型示差检测器和紫外分光光度检测器. 实验过程中的流动相采用265 mmol/L CH3COOH/200 mmol/L CH3COONH4 (pH=4.5)的缓冲溶液，测试前利用0.22 μm的微孔滤膜过滤2遍. 首先进行淋洗模式，后切换至聚焦模式，流动相流经检测器的流速和聚焦流速分别为1和1.5 mL/min，维持2 min，之后在聚焦模式下进样200 μL并维持3 min，随后由聚焦模式切换回淋洗模式，交叉流速在10 min内由2.0 mL/min呈指数衰减到0.1 mL/min，并在10 min内一直维持0.1 mL/min. 最后在无交叉流速的情况下进一步洗脱，将流道冲洗干净，从而保证下一次实验基线的稳定[30,31].首先，利用AF4与多检测器联用设备对3种不同分子量的壳聚糖进行分子量与链构象的表征. 样品先通过AF4进行分离，得到不同级分的单分散样品. 分离后的各个级分流经静态光散射检测器和示差检测器，得到不同级分在不同角度散射下的散射光强以及各级分的浓度. 在Wyatt Astra软件上对数据进行收集和分析，利用Berry公式KcRθ=1M1+8π2n23λ2Rg2sin2θ2进行线性拟合[32~34]，各级分在不同角度的散射光强下对散射角度作图，通过直线的截距可得到样品的分子量M，通过斜率可得到样品的回转半径Rg. 表1列出了本文所用3种壳聚糖的基本信息.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23253.T001Table 1Information of precursor chitosan chain.SampleDD a(%)Mw b(kg/mol)Mn b(kg/mol)Nn bRgz c(nm)CS95-2095.464.749.430325.5CS95-20095.2191.7107.766052.1CS95-300093.5378.0189.9116077.6a Degree of deacetylation (DD) obtained from 1H-NMR on a Bruker 400 MHz spectrometer; b Average number of monomers per chain calculated from 163.1 g/mol per monomer; c Weight-average molar mass Mw, number-average molar mass Mn, and z-average radius of gyration Rgz of chitosan precursor determined by AF4-MALLS.随后用AF4与多检测器联用设备检测交联反应不同阶段的凝胶颗粒的结构与分布. 将京尼平的甲醇溶液逐滴加入壳聚糖溶液(0.2 mg/mL)中，在搅拌5 min后，用0.45 μm的亲水PES过滤膜过滤出溶液(先混合后过滤而非先过滤后混合是为了防止混合搅拌过程中引入杂质，混合过程在室温下迅速进行，交联反应几乎不发生)，随后在37 ℃恒温自动进样器中进行交联反应. 在不同反应阶段，将200 μL样品注入室温运行的AF4分离系统中. 该交联反应持续48 h，每43 min进样1次.1.3单机动态光散射实验(DLS)使用Wyatt DynaPro Nanostar动态激光光散射仪，在658 nm波长下进行测试，散射光角度为90°. 将京尼平甲醇溶液逐滴加入壳聚糖溶液中，得到混合溶液中包含0.2 mg/mL壳聚糖和不同浓度的京尼平. 将混合溶液进行搅拌并脱气，然后利用0.45 μm孔径的滤膜过滤注入石英池中，实验温度为37 ℃，反应时间为48 h，每10 min收集1次动态光散射数据.1.4壳聚糖纳米凝胶稳定高内相乳液的制备与1.3节中的实验方法类似，制备得到500 mL包含0.2 mg/mL壳聚糖和54.5 μg/mL京尼平的纳米凝胶溶液，在油浴锅中37 ℃搅拌加热48 h，得到深蓝色纳米凝胶溶液. 将由CS95-200为预聚物制备得到纳米凝胶溶液利用超滤杯进行浓缩，由原本的0.02 wt%浓缩至0.57 wt%. 将浓缩后的壳聚糖纳米凝胶溶液与葵花籽油进行混合，在分散机(IKA T18均质机，德国)上，以5000 r/min转速分散溶液1 min，形成均一的乳液. 按照上述方法，调整混合溶液中油相浓度为75%~95%，进行5组对照实验.2结果讨论2.1分子量和交联剂含量对纳米凝胶平均链尺寸的影响首先选取了3种不同分子量的壳聚糖CS95-20，CS95-200和CS95-3000作为预聚物，研究预聚物分子量对纳米凝胶平均尺寸的影响. 3个样品初始溶液浓度均控制在c=0.2 mg/mL，京尼平的浓度为54.5 μg/mL. 对于CS95-200，我们此前的研究表明其重叠浓度为c*=1.3 mg/mL，因此其c/c*=0.15，对于CS95-20和CS95-3000，可以利用Gauss链(预聚物构象满足Gauss链的假设会在后续图4中得到证实) c*~Mn-1/2的标度计算CS95-20和CS95-3000溶液的c/c*分别为0.10和0.20，表明3个样品的溶液浓度均远小于重叠浓度.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23253.F002Fig. 2(a) Average hydrodynamic radius Rh of (a) CS95-20, CS95-200 and CS95-3000 crosslinked by genipin with fixed r=5 at 37 ℃, and (b) CS95-200 crosslinked by genipin with varied r = 1‒100 as indicated and CS indicates the sample of pure chitosan unreacted with genipin.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23253.F003Fig. 3(a) UV, (b) RI and (c) LS response during the reaction of the mixed solution of chitosan and genipin for 48 h are obtained respectively. The dotted line in (b) is value of 0 for the baseline. The vertical dashed line at 6 min marked the starting time of the elution step, and the retention time t0 of the void peak located at ~6.5 min is indicated by an arrow.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23253.F004Fig. 4Plots of radius of gyration Rg against M for (a) CS95-20, (b) CS 95-200 and (c) CS95-3000 obtained after different reaction time as indicated. The solid line is Rg = 0.103M1/2, while the dashed line is Rg = 0.071M1/3.为了更直观地表明实验的参数，利用壳聚糖单体的分子量163.1 g/mol可计算出壳聚糖单体在溶液中的物质的量浓度为1.2 mmol/L，而京尼平的浓度为54.5 μg/mL，利用京尼平的分子量226.2 g/mol可计算出其物质的量浓度为0.24 mmol/L，因此壳聚糖单体和京尼平的摩尔比为r=5. 分别命名3个样品为CS95-20/5、CS95-200/5和CS95-3000/5.随后，选取了分子量居中的壳聚糖CS95-200，在很宽的范围内(2.7~272.2 μg/mL)改变京尼平的浓度，对应的r=100到1，跨越了2个数量级，样品命名为CS95-200/r. 由于京尼平为双官能度，而脱乙酰度为95%壳聚糖可以看成具有0.95的官能度，因此等当量点发生在0.95r/2 = 1，即r=2.1的位置，因此r=100到1跨越了等当量点.图2(a)和2(b)分别展示了改变分子量和改变京尼平含量得到的纳米凝胶的流体力学半径Rh随着反应时间的变化. 图2(a)中可见，不同分子量预聚物形成纳米凝胶的过程中，Rh均经历了3个阶段的变化：其中阶段Ⅰ为0~4 h，此时纳米凝胶的尺寸仅发生缓慢增长，为交联反应的诱导期；阶段Ⅱ为4~12 h，此时凝胶尺寸迅速增长；阶段Ⅲ为12 h后纳米凝胶尺寸趋近于稳定，并有轻微的下降趋势，这意味着在这一阶段纳米凝胶的结构通过链内的交联变得更加紧凑. 从图2(b)可见，交联过程仅在r=5、2.5、1，3种情况下才与图2(a)中r=5的情况类似出现3个阶段，其中阶段I和II都会随着京尼平浓度的增加(即r降低)而加速，但是最终在阶段III达到的平均尺寸近似. 然而，一旦继续降低京尼平的浓度，即增加r到10和25后，可以看到尺寸增长明显放缓，且达到平衡时的尺寸明显更小，这可能说明随着交联剂含量降低，链间交联的概率减小. 继续增加r到33或42后，几乎看不到Rh的明显增加，表明链间交联很难发生. 利用壳聚糖Kuhn链段的分子量MK=6330 g/mol可计算得到每个Kuhn链段含有约39个单体，因此当r增加到39或者更高的时候，交联分子的含量小于了体系中的Kuhn链段的数量. 此时链内交联可消耗大多数的交联剂，使得链间交联的概率大大降低.DLS实验所得到的Rh仅仅是体系中平均的尺寸变化，为了了解其结构的多分散性，需对纳米凝胶进行分离表征. 接下将分别讨论交联过程的动力学和交联完成后的尺寸分布细节，进一步厘清交联过程的结构演变机制.2.2交联反应的动力学利用非对称流场流分离技术(AF4)对样品进行分离处理，表征分子量与尺寸的分布随着交联过程的变化. 由于图2中展示了链间交联仅在足够小的r下才能够发生，而我们制备纳米凝胶一定需要足够量的链间交联，因此选择r=5研究不同分子量壳聚糖样品的交联过程.图3为37 ℃下无重叠的CS95~200壳聚糖链 (浓度为0.2 mg/mL~c*/6)和京尼平分子(浓度为54.5 μg/mL在反应48 h过程中的AF4-UV-LS-RI色谱图. 在聚焦过程中，未反应的京尼平小分子已由截留分子量为10 kg/mol的半透膜滤掉. 壳聚糖上的氨基葡萄糖单元与京尼平反应后有明显的紫外吸收峰. 图3(a)为280 nm下样品的紫外吸收信号峰，随着反应的进行紫外信号峰面积迅速增长，逐渐在保留时间为11与16 min位置形成2个比较强的吸收峰，反映出壳聚糖与京尼平反应程度的增强. 图3(b)的RI信号为单峰，保留时间为10~11 min，随着反应的进行RI峰位置向低分子量区域移动，相比之下在高分子量保留时间为15~16 min区域的信号弱很多，呈现肩峰状态至多占总峰面积的5%. 由于RI和UV信号分别与反应后的纳米凝胶的浓度和交联位点(Glu-GNP)的浓度成正比，因此壳聚糖纳米凝胶的摩尔质量越高，交联位点的密度就越高. 图3(c)为LS信号吸收峰，由于反应前后的LS信号强度差异明显，0和2.9 h的结果与基线无异，因此我们利用图右侧的新坐标将0和2.9 h的结果放大了100倍. 反应进行初期，在高分子量保留时间处会出现新的LS信号峰，随着反应的进行新出现的信号峰逐渐增强，并向低分子量保留时间位置移动，在进行到48 h后会停留在16 min保留时间处.图4展示了3种不同分子量预聚物在48 h交联反应过程中，纳米凝胶回转半径Rg相对于分子量M的曲线随着反应时间的演变. 其中实线是Rg = 1/6lK(M/MK)1/2 = 0.103M1/2计算得到的壳聚糖在缓冲液中的链尺寸随着分子量的变化. 1/2为Gauss链的标度，选择此标度的依据是Zhao等[26]此前的工作，他们根据缓冲液的离子强度计算得到了体系的德拜长度rD=0.67 nm，远小于lK=20 nm，因此在Kuhn链段尺度之上，可以认为高分子为近似的Gauss链，该计算结果很好地反应了交联之前预聚物的高分子链(蓝色)的Rg随M的变化.图4中虚线是Rg = (3M/4πNAVρ)1/3 = 0.071M1/3计算得到的尺寸，其中NAV为阿伏伽德罗常数，ρ=1.1 g/cm3为壳聚糖的密度，3/4π来自颗粒是球形的假设，因此虚线为实心球颗粒对应的行为. 从图中可以看出，随着交联的进行，第I个阶段中Rg相对M曲线的高Rg部分的链首先发生弯折，此时应对应链内交联优先发生在尺寸较大预聚物链上，进入第II阶段，曲线整体向右移动，表明发生了较多的链间交联，使得体系的分子量整体增加. 然而，分子量106 g/mol以上(远大于预聚物的重均分子量，见表1)的纳米凝胶的尺寸增加却并不明显. 这表明虽然链间的交联能够导致分子量的大幅增加，但是链尺寸增加的幅度远低于分子量增加的幅度.我们在此前的工作中讨论了这种特殊的分子量和尺寸演变的机制：分子量的增加伴随着氨基的消耗，链上离子数的减少和链内氢键被破坏，直接的后果是高分子链的疏水性的增加和链刚性的降低，两者都会抑制尺寸的增加. 随着反应的持续进行，高分子量部分链尺寸又发生上翘，这主要由于当壳聚糖颗粒内部的密度逐渐接近壳聚糖本体密度后，链内交联几近饱和，但由于颗粒疏水性的增加，颗粒间会发生一定程度的聚集从而形成更大尺寸聚集体. 此前的研究结果表明，聚集体的含量在整个体系中的含量不到5%，体系中的主体还是尺寸较为均匀，但分子量分布很宽的凝胶颗粒.2.3交联反应完成后的产物尺寸分布的M依赖性虽然我们在此前的工作中报道过图4(b)结果，但没有讨论尺寸分布对于预聚物分子量的依赖性. 图5(a)对比了48 h反应完成后，基于不同预聚物的纳米凝胶回转半径Rg相对分子量M的曲线. 从图中可以观察到，即使预聚物链的分子量不同，但最终得到的产物的Rg~M曲线行为非常近似，都是链尺寸先随分子量的升高而增大，在分子量106~108 g/mol范围内Rg出现平台，最后在108以上尺寸显著增加. 对于CS95-200，我们此前工作提出CS95-200产生40 nm左右的Rg平台主要与链刚性有关. 由于壳聚糖链的Kuhn链段长度为20 nm，当链内的交联反应发生时，链弯曲势能会限制链的弯曲与折叠，限制了链内交联发生的尺度.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23253.F005Fig. 5Plots of (a) radius of gyration Rg after 48 h reaction, (b) Rg normalized by Rg,nor with inset plots of Rg,nor against Mn and the dashed line represents Rg/Rg,nor = 1, (c) UV adsorption coefficient ε and (d) chain density ρ(Rg). All parameters are plotted against M.该机制在本工作中得到了进一步地证实. 首先，我们注意到，虽然预聚物的分子量从CS95-20到CS95-3000增加了6倍，其Rg平台的尺寸仅小幅度地增加，为了进一步定量说明Rg平台增加的幅度，在图5(b)中采用了归一化(normalization)的方法，即选取平台值Rg,nor将Rg归一化，并将Rg/Rg,nor重新对M作图. 从图5(b)中可见，归一化后3条曲线在Rg平台到左侧的区域几乎完全重合，说明其整体的尺寸分布非常近似. 同时，将Rg,nor对预聚物Mn作图5(b)内部的插图，Rg,nor的Mn依赖性非常弱，可以用Rg,nor~Mn0.23的标度近似地表示. 需要指出的是，该标度关系并不表示纳米凝胶尺寸的分子量依赖性，而是表示在不同的预聚物分子量条件下，相同分子量的纳米凝胶的尺寸的区别，这种尺寸的区别与体系中的超支化的拓扑结构相关：由于CS95-20、CS95-200和CS95-3000的分子量之比近似于1:3:6，因此CS95-20和CS95-200可以分别看成CS95-3000经过6等分和2等分切割得到的链，切割后的短链需要经过更多次的链间交联才能达到相同的分子量，因此预聚物分子量越小，得到的凝胶支化程度越高，尺寸也越小.为了进一步验证上述推论，图5(c)和5(d)分别展示了纳米凝胶紫外吸收系数ε和链内的局部密度ρ(Rg). 其中，图5(c)中的紫外吸收系数可通过ε=AL·c计算，其中A为壳聚糖与京尼平反应后在280 nm产生的紫外吸收峰的信号强度，L为样品池的厚度，c为壳聚糖浓度，由于3个样品的单体和交联剂的浓度均相同，使用的样品池尺寸也相同，所以ε的差别主要源于A的差别，可以用ε来表明反应程度的高低. 图5(d)展示了通过ρ(Rg) = 3M/(4πNAVRg3)计算得到的链内局部交联密度. 从图5(c)和5(d)同时也可以看出，预聚物链的分子量越低，在形成相同分子量M的产物的εmicrogel越大，表明交联程度越高；ρ(Rg)也越大，表明纳米凝胶颗粒支化程度更高，内部密度更大，因此尺寸更小，该结果支撑了我们此前对于Rg,nor~Mn0.23标度的讨论.图6(a)展示了不同交联剂浓度下(r = 1~100)，壳聚糖CS95-200与京尼平经过48 h反应后得到的纳米凝胶的回转半径Rg与M的关系. 此前在图2中，展示了通过平均流体力学半径Rh随着反应时间的变化可以将样品归为3类：几乎不发生链间交联的r=100和50样品，过渡区域的r=25和10样品和充分发生链间交联的r=5，2.5和1样品，通过比较图6(a)中这些样品的尺寸分布，可以进一步认识这些样品结构上的区别.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23253.F006Fig. 6Plots of (a) radius of gyration Rg, (b) UV adsorption coefficient and (c) chain density ρ(Rg) against M for the samples obtained after 48 h reaction. The solid line in (a) is Rg = 0.103M1/2, while the dashed line in (b) is Rg = 0.071M1/3. Among them, CS represents the sample of pure chitosan unreacted with genipin.首先，对于r=100、50的样品，发现其与预聚物样品相比只是高M部分发生了弯折，低M区域稍许向高M移动，上述结果均表明样品内部仍以链内交联为主，这是由于配制的溶液c/c*=0.15，分子链重叠水平不高，在交联初期以链内的交联为主. 由于体系中的链尺寸分布较宽，大尺寸的预聚物可发生更多的链内交联，使得高M部分尺寸下降. 其次，对于r=25和10的样品，Rg平台逐渐凸显出来，但是从r=50到25再到10，其平台随着交联剂的增加而降低. 虽然交联剂含量增多可以同时增加链内和链间交联，但平台处的尺寸下降表明链内交联仍占主导. 当交联剂的含量继续增加时，即当r=5，2.5和1样品，Rg平台对应的链尺寸发生了反转，即增加交联剂的含量，平台的高度不降反增. 从图2中可见，对于r=5、2.5和1，3个样品，反应后期的平均Rh的演变方式几乎一致，但显然3个样品内部的链尺寸分布是不同的.我们预测的等当量点在r=2.1的位置. 当体系达到等当量点附近时，大量的氨基在反应初期被壳聚糖和京尼平的第一步交联反应消耗，此时可供进一步发生第二步链内或者链间交联的位点随着交联剂的增加而减少. 因此，平台尺寸的变化出现了翻转. 结合图6(b)和6(c)的结果可以进一步理解该转变，图6(b)中，随着交联点含量的增加，反应的程度一直在增加，表明与壳聚糖反应的位点数量仍随着交联点数量的增加而增加，这是由于如果壳聚糖的氨基和壳聚糖数量相等时r=2.1/2=1.05，因此即使r从2.5降低到1.0时，仍然可以使得反应程度增加. 但如果从京尼平的角度来看，可能单个位点悬挂交联剂的分子数量相较于双位点的有效交联的交联剂的分子数量也在上升. 该解释与6(c)中的结果一致，当r从100降低到10的过程中，相同M的Rg内的链内密度一直在增加，但是当r继续从10降至1时，相同M的Rg内的链内密度在高M的区域不增反降.图7所示的过程进一步解释了上述机制：当交联剂不足时，增加交联剂的含量可以同时提高链内和链间的交联程度，但是当交联剂将达到等当量点时，由于大部分的氨基位点被占据，反而让双位点的有效交联变得更加困难.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23253.F007Fig. 7The diagram shows three possible reaction of chitosan and genipin: (a) chitosan is excessive; (b) both chitosan and genipin react completely; (c) genipin is excessive.2.4壳聚糖纳米凝胶溶液高内相乳液研究利用CS95-200/5浓缩制备了高内相乳液. 壳聚糖纳米凝胶的尺寸为40 nm左右，低于Hu等[24]制备的200 nm，因此比表面积更大. 图1(d)显示了高内相乳液的形态，其中黄色和蓝色区域分别是内部油相和外部水相. 根据Hu等的工作，壳聚糖纳米颗粒具有亲油性和亲水性的平衡，可以在界面处驻留. 在本研究中制备的纳米凝胶颗粒亦具有很高的乳化性能. 图8中分别为不同油相比例制备得到乳液的照片，上图为刚制作完成的乳液，下图为倒置10 min后的乳液. 从图中可知，壳聚糖浓度为0.57 wt%的纳米凝胶溶液在含油量90%以下所制备出的乳液均可以倒置不流动，表明内部的网络结构可以支撑自身重力，本工作中制备的纳米凝胶可以作为稳定界面的乳化剂使用，这是由于(1)壳聚糖与京尼平交联后，纳米凝胶内部京尼平含量增加导致亲水性的降低和其亲油性的增强，最终产物具有比较平衡的亲水和亲油性和相应的乳化功能；(2)纳米凝胶尺寸小增加了其比表面积；(3)尺寸的均一性让其在水油界面能够大面积稳定，上述三方面性质均有利于改善乳化性能.10.11777/j.issn1000-3304.2023.23253.F008Fig. 8Photographof the high internal phase emulsions (HIPEs) stabilized by the CS-GNP of 0.57 wt% with different oil volume fractions.3结论我们研究了不同分子量(重均分子量从64.7 kg/mol增加到378 kg/mol)的预聚物链的分子量对于交联反应动力学的影响. 发现预聚物分子量的变化不会改变交联产物基本的分布特征，对于3种预聚物分子，均可在反应完成后观察到宽分子量分布的纳米凝胶具有较窄的特征尺寸分布. 当预聚物和交联剂的浓度均相等时，该特征尺寸随着预聚物分子量的减小而减小(图5)，这可能是由于低分子量的样品形成的凝胶具有更高度的支化结构. 该结论也通过比较产物的交联程度和链内密度得到了进一步证实，随着预聚物分子量的减少，相同分子量凝胶的交联程度和链内密度都得到提高.对于预聚物相同的体系，通过控制交联剂的含量可以控制反应的程度. 从动态光散射得到的平均尺寸的增长在交联剂含量足够时似乎达到了饱和. 然而，通过尺寸随着分子量的变化图(图6(a))可以发现，当交联剂达到一定的浓度后，继续增加交联剂含量反而会抑制第二步交联，这可能是由于过量的交联剂通过第一步的交联反应过多地占据了交联位点，抑制了第二步的交联反应，使得产物链内的浓度不增反降.最后，选择了部分的纳米凝胶样品测试了其乳化效果. 发现仅使用0.57 wt%的纳米凝胶就可以得到稳定的Pickering乳液，其中的含油量可以高至90 wt%. 我们分析了纳米凝胶具有优异的乳化性能的几个关键因素：一是尺寸比较均匀且比表面积大，有利于纳米颗粒在比较清晰的水油界面的大面积聚集；二是分子量的宽分布造成了亲疏水/油性的宽分布，即分子量更大，内部局部浓度更高的样品往往具有更高的疏水性和亲油性，这种分布会造成界面处同时存在稳定水相和油相的纳米颗粒. 然而，这种分布对于最终乳化性能的影响机制仍不完全明确，值得更多的探索.