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光交联交替层状自组装(LBL)抗菌膜的制备及其性能研究
研究论文 | 更新时间：2024-10-08
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    • 光交联交替层状自组装(LBL)抗菌膜的制备及其性能研究

    • Preparation and Characterization of Photo-crosslinked Layer-by-Layer (LBL) Self-assembled Antibacterial Films

    • 王学斌

      ，  

      薛源

      ，  

      周耀武

      ，  

      陈声毅

      ，  

      包春燕

      ，  

      朱麟勇

      ，  
    • 高分子学报   2022年53卷第2期 页码：133-144
    • 作者机构：

      上海市功能性材料化学重点实验室 华东理工大学化学与分子工程学院 上海 200237

    • 作者简介：

      E-mail: baochunyan@ecust.edu.cn

    • DOI：10.11777/j.issn1000-3304.2021.21182    

      中图分类号：

    • 纸质出版日期：2022-02-20，

      网络出版日期：2021-11-15，

      收稿日期：2021-07-05，

      录用日期：2021-09-13

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  • 引用本文

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  • 王学斌,薛源,周耀武等.光交联交替层状自组装(LBL)抗菌膜的制备及其性能研究[J].高分子学报,2022,53(02):133-144. DOI： 10.11777/j.issn1000-3304.2021.21182.

    Wang Xue-bin,Xue Yuan,Zhou Yao-wu,et al.Preparation and Characterization of Photo-crosslinked Layer-by-Layer (LBL) Self-assembled Antibacterial Films[J].ACTA POLYMERICA SINICA,2022,53(02):133-144. DOI： 10.11777/j.issn1000-3304.2021.21182.

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    摘要

    针对静电超分子作用的交替层状自组装(LBL)膜稳定性差、易分解和难以实现应用的问题，设计合成了一种光交联型抗菌LBL多层膜. 该LBL多层膜由修饰有光敏邻硝基苄醇分子的透明质酸(HANB)与季铵化的壳聚糖(ACS)通过静电作用在基片上交替沉积而成. 光照后，HANB上的邻硝基苄醇分子产生活性醛基，与邻近壳聚糖上的氨基发生亚胺偶联反应，实现了LBL多层膜的光交联. 实验证明交联后的LBL膜具有很好的稳定性，能在不同pH值盐溶液中长期保持膜的完整性. 壳聚糖的抗菌特性赋予LBL膜良好的抗菌性能，亲水性生物大分子骨架的选取赋予LBL膜良好的细胞相容性. 与其他化学交联方法相比，邻硝基苄醇光交联策略无需任何引发剂或添加剂的引入，具有更好的生物相容性，为医疗植入物表面抗菌涂层的构建提供新方法.

    译

    Abstract

    Bacteria are one of the oldest life forms on the earth. They have strong adaptability to various environments and can be seen almost everywhere on the earth. Bacteria will adhere to different surfaces and then reproduce to form dense aggregates or biofilms with a thickness of several microns to tens of centimeters, which will seriously affect the properties of materials, especially for medical devices. Bacterial adhesion and biofilm formation on these devices are an important reason for the failure of medical implantation and the formation of large-area medical infection. Therefore, researchers are focusing on developing antibacterial surface coatings to eliminate or prevent the initial adhesion of bacteria and biofilm formation on the surface of materials. Alternating layered self-assembly (LBL) film, as the most popular coating technology, is applicable to the surface of various materials. Due to its advantages of simple operation, high controllability and easy functionalization, LBL film is widely used in separation technology, sensor, controlled drug release, surface modification of biomaterials and so on. However, its inherent shortcomings, such as poor stability, easy decomposition, etc., greatly limit their applications. To solve the above problems, a kind of photo crosslinking antibacterial LBL membrane was designed and prepared by alternating deposition of photosensitive o-nitrobenzyl alcohol modified hyaluronic acid (HANB) and quaternized chitosan (ACS) on the glass substrate through electrostatic interaction. The photoligation reaction of o-nitrobenzyl alcohol to amine of chitosan enables the crosslinking of the assembled polyelectrolyte membrane, which stabilizes and maintains the integrity of the membrane for a long time in salt solutions with different pH values. The antibacterial property of chitosan endows LBL membrane with good antibacterial property and strong electrostatic supramolecular interactions with HANB. Cytotoxicity analysis confirms the cytocompatibility of the LBL membranes. Antibacterial experiments show that the non-photocrosslinked LBL membrane shows higher release-sterilization due to the release of quaternized chitosan to the solution. However, the photocrosslinked LBL membrane shows better contact-sterilization due to the membrane stability, which is more friendly to the environment. Compared with other chemical crosslinking methods, o-nitrobenzyl alcohol photocrosslinking strategy has better biocompatibility without the introduction of any initiator or additive, which provides a new idea for the construction of antibacterial coating on the surface of medical implants.

    译

    图文摘要

    abstract

    设计合成了一种基于邻硝基苄醇光交联反应的抗菌LBL多层膜. 该LBL膜具有良好生物相容性的同时，能在不同pH值盐溶液中长期保持稳定并具有良好的抗菌性能，为医疗植入物表面抗菌涂层的构建提供了新方法.

    译

    关键词

    交替层状自组装膜; 抗菌涂层; 光交联; 细胞相容性

    译

    Keywords

    Alternating layered self-assembly film; Antibacterial coating; Photocrosslink; Cytocompatibility

    译

    本文附有电子支持材料，与正文一并刊登在本刊网站http://www.gfzxb.org

    译

    细菌是地球上最古老的生命形式之一，对各种环境的适应能力极强，在地球上几乎随处可见. 细菌会附着在不同的表面上，随后繁殖，形成厚度从几微米到几十厘米的密集聚集物或生物膜. 材料表面生物膜的形成会严重影响材料的性质[

    1~3]，例如在医疗器械领域，器械表面细菌黏附和生物膜的形成是导致医疗植入失败，形成大面积医疗感染的一个重要原因[4,5]. 因此，研究人员一直致力于开发抗菌表面涂层去消除或防止材料表面细菌最初的黏附和生物膜的形成[6~10].
    译

    截至目前，科学家们研发出了多种材料表面抗菌膜涂层的制备方法，包括表面引发聚合物毛刷[

    11]、水凝胶[12]和交替层状组装法(layer by layer，LBL)涂层[13]等. 其中，LBL是一种多功能涂层技术，适用于各种材料表面，通过静电、氢键、金属配位等超分子作用，可以随意在膜中引入不同物质，包括功能有机分子、金属离子、纳米颗粒、生物大分子(DNA、蛋白质)和病毒等[14,15]. 由于具有操作简便、可控性高、适用范围广等优点，LBL膜被广泛用于分离膜[16]、传感器[17]、药物控释[18]和生物材料表面改性等领域[19]. 然而，LBL膜层之间弱超分子相互作用导致多层膜的稳定性不高，容易受周边环境影响(如高离子强度、强酸、强碱和氧化还原剂等)而导致膜的破坏，从而限制了多层膜的进一步应用[20,21]. 针对这一问题，许多研究者致力于将层间-层内的弱相互作用转变为较为稳定的共价键作用来提高多层膜的稳定性，这些共价交联LBL膜的成功制备有助于推进交替层状组装技术的产业化应用[15].
    译

    光由于具有非物理性接触、时空、剂量可控等优势，光交联反应一直备受研究者们的青睐，被广泛应用于多种材料的制备. 基于课题组多年在邻硝基苄基光剪切、光偶联反应领域的研究基础[

    22,23]，本文旨在利用邻硝基苄醇分子光生醛基、醛基-氨基偶联反应实现聚电解质LBL交联多层膜的制备，并探索其在抗菌领域的应用. 如图1所示，通过静电作用将邻硝基苄醇修饰的透明质酸衍生物(HANB)与季铵化的壳聚糖(ACS)交替沉积到玻璃基片上形成LBL聚电解质多层膜，透明质酸的亲水作用可以在膜表面形成水化层抵御细菌和蛋白的非特异性黏附，壳聚糖的杀菌性赋予LBL膜抗菌性能. 光照后，HANB上的邻硝基苄醇分子产生活性醛基，与邻近壳聚糖上的氨基发生亚胺偶联反应，实现层与层的共价交联，从而增加膜的稳定性. 结合其表面抗菌的性能，这种光交联稳定的聚电解质膜为整形植入物、医疗器械和手术台的内外表面涂层构建提供新思路.
    译

    fig

      

    Fig. 1  (a) Synthesis and molecular structures for the polyelectrolytes. (b) Schematic presentation of preparation of LBL membrane and subsequent photocrosslinking.

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    1 实验部分

    1.1 实验药品与仪器设备

    本实验中，透明质酸钠(Hyaluronic acid，HA，340 kDa)购于山东福瑞达医药公司；壳聚糖(GC，high viscosity)、牛血清白蛋白(BSA)和异硫氰酸荧光素(FITC)均购于Sigma公司；磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L，pH=7.2)、DMEM高糖培养基、α-MEM低糖培养基均购于HyClone公司. 本实验中所用的细胞培养基为DMEM高糖培养基或α-MEM低糖培养基均包含10% FBS(V/V)和1%青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin). 所有其他化学试剂和溶剂购自于Aladdin、TCI、Macklin公司. 二氯甲烷和三乙胺通过氢化钙重蒸干燥后使用. 酵母抽提物、蛋白胨、琼脂、牛肉提取物和血琼脂板购于北京陆桥科技有限公司. 金黄色葡萄球菌(ATCC，25923)购自于上海微生物保藏中心. 细菌活/死活性试剂盒(LIVE/DEADTM BacLightTM Bacterial Viability Kit)和细胞活/死活性试剂盒(CelltrackerTM Red CMTPT)均购自Invitrogen公司(赛默飞). 所用的HeLa细胞与MC3T3细胞均购于中国科学院上海科学院细胞库. 测试所用的玻璃基片与石英基片(1 cm × 4 cm)均购于上海众承公司.

    译

    核磁数据由Bruker-Avance 400/600 MHz核磁共振仪测得，以Me4Si作为内标. 高分辨和低分辨质谱数据由Micromass GCTT与Micromass LCTTM质谱仪测得. 紫外光谱数据是由岛津UV-2550紫外分光光度计测得. 荧光光谱数据是由配有搅拌器和温度控制器的Varian Cary Eclipses荧光分光光度计测得. 高效液相色谱(HPLC)数据是由安捷伦Agilent 1200液相色谱仪测得，色谱柱为BetaBasic-C18反向色谱柱. 荧光图像是通过A1R-Nikon激光共聚焦显微镜(CLSM)测得，镜头为10×空气镜、40×水镜或60×油镜. 透射电镜(TEM)数据是由JEM-1400/2100电子透射显微镜上测得. 扫描电镜(SEM)数据是通过S-3400N扫描电子显微镜和GeminiSEM 500场发射电子扫描显微镜测得.

    译

    1.2 化合物的合成与表征

    1.2.1 化合物N-(2-氨乙基)-4-[4-(羟甲基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基]丁酰胺(NB)小分子的合成

    NB根据已有文献方法合成[

    24]. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 7.75 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 4.97 (s, 2H), 4.14 (t, J=6.1 Hz, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.31 (m, J=11.6, 5.7 Hz, 2H), 2.88 (t, J=5.9 Hz, 2H), 2.43 (t, J=7.2 Hz, 2H), 2.27~2.19 (m, 3H). ESI-HRMS: m/z calcd. for C13H17NO7 [M+H]‍+: 328.1509; Found: 328.1509.
    译

    1.2.2 HANB的合成

    将1.0 g透明质酸钠(HA)溶解到100 mL的MES (10 mmol/L，pH=4.5)缓冲液中，搅拌至完全溶解. 将NB小分子(450 mg，1.38 mmol)溶于DMSO中并加入到HA的缓冲溶液中，搅拌30 min. 再将DMTMM (300 mg × 3)分3批加入，反应过夜. 反应结束后，反应液透析(MWCO 7000) 3天，除去未反应的小分子. 冷冻干燥，得到淡黄色絮状物0.9 g. 通过核磁积分面积比，计算得到HANB的接枝率为11%.

    译

    1.2.3 季铵化壳聚糖(ACS)的合成

    将壳聚糖3.0 g溶于120 mL的10%的乙酸水溶液中，然后加入60 mL乙醇，强力搅拌，壳聚糖完全溶解后，滴加苯甲醛溶液(15.8 g，150.0 mmol)，60 ℃反应过夜，反应结束后，加入氢氧化钠(0.5 mol/L)溶液，将反应体系pH调节至7.0，过滤，乙醇洗涤3次，冷冻干燥，得淡黄色絮状固体a(3.2 g，60%产率).

    译

    将化合物a (2.75 g)研磨、粉碎，加入到250 mL三口烧瓶中，加入50 mL异丙醇溶液和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(9.0 g), 70 ℃搅拌过夜，待反应结束后，过滤反应液得到粗产物，用甲醇、丙酮洗涤3次，冷冻干燥得到白色固体b(3.4 g，产率70%).

    译

    将化合物b (3.0 g)溶于盐酸乙醇(50 mL，0.25 mol/L)混合溶液中，室温搅拌24 h，反应结束后，真空条件下，除去混合溶剂，随后加入去离子水、丙酮重沉淀，得到终产物ACS (1.9 g，产率80%). 通过核磁积分面积比计算，ACS季铵化标记率为15%.

    译

    1.3 HANB溶液与膜的光解测试

    1.3.1 HANB溶液的光解测试

    将5 mg 的HANB聚合物加入到5 mL的去离子水中配制成1 mg/mL的水溶液，然后加入到1 mm光程的石英比色皿中. 用紫外可见分光光度计分析不同光照时间间隔时候后溶液紫外吸收的变化. 光照条件为：LED 365 nm，光强10 mW/cm2.

    译

    1.3.2 HANB膜的光解测试

    取10 mg的HANB聚合物溶于1 mL去离子水中，搅拌均匀，1 μm针式过滤器过滤，取100 μL加入到处理干净的石英基片上，用涂布棒将HANB水溶液涂布均匀、自然风干，重复3次. 然后，将HANB涂层基片置于紫外可见分光光度仪中，以空白石英基片作为参比，检测不同光照时间间隔后基片紫外吸收的变化.

    译

    1.4 聚电解质多层膜的制备

    1.4.1 聚电解质多层膜前体溶液的配制

    HANB溶液：将HANB (0.5 g)溶于500 mL的NaCl (0.15 mol/L)水溶液中配制成1 mg/mL的HANB/NaCl溶液，用0.1 mol/L HCl将溶液pH调节到4.5.

    译

    ACS溶液：将ACS (0.5 g)溶于500 mL的 NaCl (0.15 mol/L)和0.1 mol/L醋酸溶液中配制成1 mg/mL的CS/NaCl溶液. 用0.1 mol/L NaOH将溶液的pH调节为4.5.

    译

    以上2种溶液在使用前均用1 μm微孔过滤器过滤、待用.

    译

    1.4.2 基片的预处理

    用于多层膜生长的基片为玻璃和熔融石英片，规格为1 cm × 4 cm. 首先，将清洗后的基片放到热的食人鱼溶液(35% H2O2/98% H2SO4，50 vol%)中浸泡20 min (注意：食人鱼溶液具有极强的腐蚀性). 然后，取出基片用纯Milli-Q水彻底清洗并使用氩气吹干. 最后，使用等离子清洗机(Plasma)将基片正反面各处理3次，每次5 min.

    译

    1.4.3 基片的表面氨基化

    将上述处理干净的基片置于15 vol%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)乙醇溶液中并加热至75 ℃反应30 min. 反应结束后，表面氨基修饰的基片在乙醇中超声处理3次，超纯氩吹干后置于10 mL的离心管中密封保存、待用.

    译

    1.4.4 聚电解质LBL多层膜制备

    将上述基片交替浸入HANB和ACS的前体溶液中，每次浸泡15 min. 在每个沉积步骤之间，用pH为4.5的NaCl溶液 (0.15 mol/L)轻轻冲洗基片，去除表面未吸附的聚电解质分子. 本研究所用的聚电解质多层膜是HANB/ACS分别经过5、10、15、20个周期静电沉积而成的薄膜，分别命名为L5、L10、L15与L20，通过紫外分光光度计和接触角测量仪来研究聚电解质的沉积过程.

    译

    1.5 LBL膜的光解测试

    以L20 (HANB/CS)20的LBL膜为测试对象，将制备好的L20膜基片，置于紫外可见分光光度仪中，以空白基片作为参比，检测不同光照时间间隔后基片紫外吸收的变化，光照条件同1.3.1节中所述.

    译

    1.6 光交联聚电解质多层膜的制备与表征

    1.6.1 LBL膜光交联

    取不同层数的聚电解质多层膜(L5、L10、L15、L20)基片，将其切割成1 cm × 1 cm规格，用LED 365 nm (10 mW/cm2)手电筒照射基片进行光交联反应，分别制得L5+hv，L10+hv，L15+hv和L20+hv光交联多层膜. 将光交联基片分别进行衰减全反射-傅里叶红外光谱(ATR-FTIR)、SEM、原子力显微镜(AFM)和X-射线光电子能谱(XPS)测试.

    译

    1.6.2 LBL膜稳定性测试

    以1 cm × 1 cm L20与L20+hv膜基片为样品，将基片放置于10 mL的离心管中，分别加入pH为5.0、7.2和9.0的NaCl (0.15 mol/L)的水溶液进行浸泡. 在浸泡1、4和8天后，取出基片用30%、50%、70%、85%、90%、95%、100%的乙醇水溶液梯度脱水. 脱水后的基片冷冻干燥12 h后用SEM分析膜表面形貌的变化.

    译

    1.7 抗菌实验

    1.7.1 金黄葡萄球菌的培养

    以革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S. aureus)为研究对象，作为抗菌实验的细菌菌株. 将新购得的菌株接种到TSB (含17 g/L胰蛋白胨、3 g/L大豆木瓜蛋白酶消化物、5 g/L NaCl、2.5 g/L 葡萄糖和2.5 g/L 磷酸二氢钾，pH=7.2)培养基中，置于37 ℃恒温摇床(150 r/min)中，培养过夜. 将菌株用接种环接种到血琼脂板上，培养24 h，培养板上如有溶血圈，则该菌株能正常使用. 将复苏好的菌株，接种到TSB液体培养基中，置于37 ℃恒温摇床(150 r/min)中培养，每隔1 h，取1 mL TSB培养基测定菌液的OD 600值，绘制细菌生长曲线.

    译

    取2 mL指数生长期的细菌菌液4 ℃离心(3000 r/min)10 min，除去上清液后，用无菌PBS洗涤3次后，配置成浓度为105 CFU/mL的菌液待用. 细菌的浓度通过标准曲线确定.

    译

    1.7.2 LBL膜抗菌活性测定

    细菌共培养测试：在抗菌测试前，将L20与L20+hv LBL膜基片切割成1 cm × 1 cm规格，在超净台中用75%消毒乙醇浸泡15 min，晾干. 然后，将基片放入24孔板中并加入1 mL细菌悬液. 在生化培养箱中37 ℃培养不同时间. 将菌液稀释成不同的浓度梯度，取200 µL到TSA琼脂板上，涂布均匀，生化培养箱37 ℃培养18~24 h，培养结束后计数.

    译

    1.7.3 LBL膜表面黏附细菌SEM观察

    上述与细菌共培养6 h后的LBL膜表面残留的细菌用3.5%戊二醛溶液或多聚甲醛固定2 h，乙醇溶液梯度脱水后冷冻干燥，SEM分析细菌黏附情况.

    译

    1.8 聚电解质LBL膜生物相容性测试

    1.8.1 细胞相容性测试

    选HeLa细胞作为模型细胞，用CCK-8测定法评估聚电解质、LBL膜的细胞毒性. 在进行细胞培养前，对聚合物前体溶液高温高压灭菌处理，对LBL膜用75%乙醇浸泡消毒. 具体操作如下：将培养于10%胎牛血清(FBS)、1% P/S的DMEM高糖培养基中的HeLa细胞进行消化、离心处理，计数后用培养基稀释成2×105 cells/mL. 将HeLa细胞以2000 cells/well初始密度接种到48孔细胞培养板中. 培养12 h后，更换新鲜培养基，然后加入不同浓度的样品与细胞共培养. 培养不同时间后，吸出培养基，向每个孔中加入500 μL新鲜DMEM高糖培养基和CCK-8试剂(20 μL)，在37 ℃下进一步培养2~3 h. 最后，用酶标仪记录450 nm处的吸光值(OD)，数据是6次实验的平均值. 细胞的存活率由如下公式所计算得到：

    译

    细胞存活率(cell viability, %)=实验组吸光度平均值对照组吸光度平均值×100%

    1.8.2 LBL膜表面细胞形态测试

    以小鼠颅顶前骨细胞MC3T3作为细胞模型，培养基为10% FBS和1% P/S的α-MEM低糖培养基，对增值后的细胞进行消化、离心、计数稀释后待用. 将消毒后的基片放入到48孔板中，随后将稀释后的细胞悬液以2000 cells/well加入到孔板中，于37 ℃的细胞培养箱中培养不同天数，培养结束后，吸出培养基，加入200 μL的PBS配制的Calcein-AM (λex=488 nm)溶液对细胞进行染色，37 ℃染色15 min后，通过激光共聚焦荧光显微镜观察并拍摄细胞生长情况和形态.

    译

    2 结果与讨论

    2.1 聚电解质的合成

    基于透明质酸和壳聚糖良好的理化特性以及它们相反的电负性，本文采用这2种聚电解质骨架来构建LBL膜. 如图1所示，首先，为了实现光交联，在聚阴离子聚合物透明质酸上引上可光生醛基的邻硝基苄醇功能基团，得到HANB (标记率11%)；其次，为了增加壳聚糖的水溶性和正电性，进行季铵化修饰，得到聚阳离子聚合物ACS(15%季铵化)；最后，分别配置溶液后得到可制备LBL膜的聚电解质溶液.具体HANB和ACS的核磁以及标记率计算见电子支持信息.

    译

    2.2 HANB的光反应动力学研究

    为了保证后续LBL膜交联反应的发生，首先对HANB的水溶液和膜分别进行光反应动力学研究. 如图2(a)所示，HANB水溶液随着光照时间的增长，265 nm处的吸收显著增强，352 nm处的吸收逐渐降低并红移到380 nm处，并且在250，295和400 nm处出现了等吸收点，300 s后光解基本完成. 等吸收点的存在表明NB的光解反应相对比较干净，可在365 nm紫外光的照射下发生有效光解. 随后，我们将HANB水溶液涂于石英片上，并对干燥成膜的基片进行光照紫外光谱测试. 如图2(b)所示, 光解动力学基本与水溶液中的一致，即随着光照时间的增长，265 nm处的吸收显著增强，352 nm处的吸收逐渐降低并红移到380 nm处，并且在295 nm处出现等吸收点，90 s内基本光解完全，说明HANB可在溶液状态和膜状态下进行有效光解，为其在LBL膜中与ACS上的氨基发生光偶联反应实现膜交联提供前提条件.

    译

    fig

      

    Fig. 2  Photolysis analysis of (a) HANB solution and (b) dry membrane.

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    2.3 LBL膜的制备

    在制备LBL膜前，采用常用的氨基硅氧烷试剂APTES对Plasma处理过的基片表面进行氨基化修饰. 如X射线光电子能谱(X-rayphotoelectron spectroscopy，XPS)分析所示(图3），空白玻璃基片在399.6 eV出现N1s信号，这应该归因于玻璃中带的N杂质，氨基化后的基片表面N元素的含量增加，通过洛伦兹-高斯拟合发现其主要特征峰为399.0与401.3 eV，分别归属为氨基(―NH2)与氨基质子化(―NH3+)的能带，说明基片表面成功氨基化，为后面能交替沉积聚电解质LBL膜提供前提条件.

    译

    fig

      

    Fig. 3  XPS analysis of amino modified glass substrate.

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    将表面修饰氨基的基片，依次沉浸到配置的HANB水溶液和CS水溶液中，对分别经过5、10、15和20次浸泡-冲洗-浸泡循环后的膜基片用紫外-可见吸收光谱来监测其吸收的变化. 对于交替沉积不同层数后的LBL膜相应定义为L5，L10，L15和L20. 如图4(a)所示，随着膜层数量的增加，紫外吸收不断增加. 以354 nm处紫外吸光值为y轴，层数为x轴作图后发现，如图4(b)所示，在20层的组装周期内，LBL自组装膜的吸收呈指数增长. 接触角测试表明(图4(c))随着层数的增加，膜表面接触角也逐渐增加，特别是20次循环后(L20)，接触角为70º左右，说明随着层数增加，表面亲水性是有所降低的. 同时，如图4(d)所示，随着层数的增加，膜的透明度也随之降低，这些结果都反映LBL聚电解质多层膜的成功制备.

    译

    fig

      

    Fig. 4  (a) UV-Vis absorption spectra, (b) the corresponding evolution of absorbance at 354 nm, (c) contact angle analysis, and (d) photo images of LBL film.

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    2.4 LBL膜光交联动力学分析

    对自组装的LBL膜进行光解动力学分析. 选取L20的膜基片作为测试对象，如图5(a)所示，随着光照时间的增长(LED 365，10 mW·cm-2)，LBL膜在352 nm处的吸收逐渐降低并红移到380 nm处，并且在295 nm处出现了等吸收点，270 s基本光反应完全，这些现象与图2(b)中HANB干膜的光解紫外图谱基本相似，说明LBL膜中的邻硝基苄醇发生了有效光解反应，但是并没有进一步与壳聚糖的氨基发生交联. 这个现象有可能由2种因素造成，一是我们期望的光生醛基、醛基-氨基的偶联反应不能在这个LBL膜内发生，二是有可能后面的偶联反应速率很慢，发生严重滞后导致. 于是，我们对基片光照后24 h内的紫外吸收变化进行了追踪. 如图5(b)所示，红移到380 nm处的π-π吸收峰随着时间的增长逐渐降低，320 nm处吸收逐渐增加并在330 nm处形成了一个等吸收点. 该结果说明HANB上的邻硝基苄醇在光照生成醛基后与壳聚糖上的氨基发生偶联反应的速度很慢，滞后24 h后才基本完成. 根据课题组以往的经验，在水溶液中由于形成自组装邻硝基苄醇的光偶联反应效率会有极大的提高[

    25]，因此我们检测了水浸润后L20膜的光反应动力学过程. 如图5(c)所示，随着光照时间的增长，354 nm处的吸收逐渐降低，在330 nm处出现了等吸收点，300 s后反应基本完成，最后的紫外吸收与图5(b)中L20干膜光照并放置24 h的紫外吸收一致，说明有水存在下醛基-氨基的偶联反应速率大大增加，没有产生任何滞后现象，整个光生醛基、醛基-氨基偶联反应可实时完成，可对LBL膜实现实时控制的光交联. 为了进一步研究聚电解质多层膜光解性质，对光反应前后HANB膜与L20膜进行了衰减全反射-傅里叶红外光谱(ATR-FTIR)分析. 如图5(d)所示，HANB和L20膜在光照后(HANB+hv)，1320与1520 cm-1处归属于―NO2的伸缩振动峰基本消失，说明邻硝基苄醇在膜中发生光解. 进一步，对光照前后的L20多层膜进行了XPS光电子能谱研究. 如图6所示，光照后C1s信号强度相对降低，进行洛伦兹-高斯分峰拟合(%Lorentzian-Gaussian=0.2)后发现L20+hv在284.83 eV对应化学基团为C―NO2 处的信号消失，而在286.5和287.9 eV处产生2组新信号，分别可归属为C＝N与H―C＝O，再次证明HANB和ACS在膜中发生了光交联. 对于光交联前后膜表面微观形貌的变化，用SEM与AFM进行了表征. 如图7所示，光照后表面变得更为平整，粗糙度降低，这应该归因于光照后层与层之间形成更为紧密交联所致.
    译

    fig

      

    Fig. 5  The evolution of UV-Vis absorption of (a) dry L20 upon the irradiation of LED 365 nm light (10 mW·cm-2) and (b) subsequent keeping in dark condition, and (c) wet L20. (d) FTIR analysis and comparison of L20 and HANB membrane before and after UV irradiation.

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    fig

      

    Fig. 7  (a) SEM and (b) AFM images of polyelectrolyte multilayer film before and after irradiation.

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    Fig. 6  XPS analysis of L20 film before and after illumination.
    inlinegraphic Position (eV) Area
    L20 L20+hv L20 L20+hv
    C―H/C―C 284.40 284.40 42258.04 28550.21
    C―NO2 284.83 6816.62
    C―N 285.50 285.50 5547.02 6437.44
    C―O 286.00 286.00 10896.36 17821.46
    C＝C 286.50 959.38
    O―C―O 287.40 287.40 3445.79 6763.15
    H―C＝O 287.90 790.91
    O＝C―N 288.20 288.20 2549.05 1892.24
    O＝C―OH 288.96 280.04
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    2.5 LBL聚电解质膜的稳定性分析

    众所周知，静电自组装的LBL膜存在不稳定的缺点，易受环境pH、盐浓度等影响. 本文光交联的目的就是增加LBL膜的稳定性. 因此，将光交联前后的基片浸泡在不同pH的缓冲液中，通过SEM与X射线能谱分析(EDS)比较膜在光交联前后的稳定性. 同样，选择L20与L20+hv聚电解质多层膜为测试样品. 如图8(a)所示，L20与L20+hv膜基片在不同pH值的盐溶液中(0.15 mol/L NaCl，pH=5.0、7.2和10.0)浸泡不同天数后，光照后的膜具有显著的稳定性，即使浸泡8天后，表面几乎没有发生变化. 相反，未光交联的L20膜在1天后膜表面就出现鼓泡现象，并随着浸泡时间的延长，表面发生部分膜脱落现象. 在不同盐浓度中的稳定性结果类似，即光照后的膜即使经过8天的浸泡仍然保持很好的稳定性(图见电子支持信息). EDS能谱分析表明，如图8(b)所示，在浸泡4天后，L20基片表面膜不完整，表面Si和Na元素含量明显偏高；而L20+hv基片的膜保持完整，表面C、N元素含量相对较多. 通过计算Si/C的比值，L20为28%，L20+hv为16%. 另外，通过监测浸泡前后膜厚度变化发现，L20+hv膜厚几乎不改变，维持在2.0 µm左右，而L20的膜厚减小到0.5 µm以下. 以上结果说明了光交联后聚电解质膜具有良好的稳定性.

    译

    fig

      

    Fig. 8  (a) SEM images and (b) EDS analysis of L20 and L20+hv membrane after soaking in salt solution with different pH values.

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    2.6 聚电解质多层膜的抗菌性研究

    为了确定聚电解质多层膜的杀菌性能，以金黄葡萄球菌为细菌模型，分别分析了光交联前后L20和L20+hv膜基片的抗菌活性. 如图9(a)所示，通过膜基片与细菌的共培养、涂板计数分析发现控制样中的细菌活性降低不到10%，未光交联的L20膜基片展现最大的抗菌性，只有不到15%的细菌存活率，光交联后的L20+hv膜基片，细菌存活率为38%. 这些实验结果说明聚电解质多层膜对金黄葡萄球菌均有一定的杀灭作用. 通过对比发现，L20基片的杀菌活性明显高于L20+hv膜基片，这是因为未光照的多层膜在溶液中不稳定，会导致季铵化壳聚糖分子游离到菌液中，从而提高了杀菌效率. 而光照后的L20+hv膜基片，由于膜结构稳定，细菌只有接触到膜表面才能被杀灭，相比来说对环境更友好. SEM显微镜测试进一步表明，如图9(b)所示，空白基片上黏附较多的细菌并且细菌结构完整，而LBL膜基片表面黏附的金黄葡萄球菌相对少，黏附的细菌结构发生了破坏，说明多层膜对细菌具有一定的杀菌作用.

    译

    fig

      

    Fig. 9  The antibacterial analysis of L20 and L20+hv: (a) cell viability and (b) SEM images.

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    2.7 聚电解质多层膜的细胞相容性分析

    最后，对聚电解质多层膜的细胞相容性进行了分析. 以HeLa细胞为模型细胞，如图10(a)所示，不同层数、光交联前后的LBL膜基片的细胞存活率都在95%以上，表明多层膜聚电解质膜具有很好的细胞相容性. 同时，又选取MC3T3作为细胞模型，对聚电解质多层膜表面细胞黏附行为进行了考察. 如图10(b)所示，通过与基片4天培养，在L20与L20+hv膜基片表面细胞黏附很少，而在培养皿中的细胞生长情况良好，在4天后发生很好的铺展(图10(c)). 这些结果说明L20与L20+hv多层膜对细胞具有良好的生物相容性.

    译

    fig
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    Fig. 10  (a) Cytotoxicity test of LBL membranes. (b) Confocal images of cells (Live/dead staining) adhered on the substrates after 4 days coculture. (c) Confocal images of cells in the culture dish after 4 days coculture.

    3 结论

    针对常规基于静电作用的LBL膜稳定性差的问题，本文提出利用邻硝基苄醇光生醛基、醛基-氨基偶联反应光交联透明质酸和季铵化壳聚糖的交替沉积膜，增加膜稳定性的同时实现抗菌功能. 经过LBL多层膜理化性质研究、细菌、细胞实验测试，得出以下结论：(1)通过光交联反应，增强了多层膜的结构稳定性，能在不同pH的盐溶液中保持膜的完整性；(2)膜中存在的季铵化壳聚糖分子，使LBL膜对金黄葡萄球菌具有一定的抗菌作用；(3)亲水性生物大分子骨架的使用和温和的光偶联反应使光交联膜具有良好的细胞相容性. 这些性质为光交联聚电解质膜进一步用作整形植入物、医疗器械和手术台的内外表面的抗菌涂层提供可能.

    译

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    中国科学院宁波材料技术与工程研究所 中国科学院海洋新材料与应用技术重点实验室
    东华大学化学化工与生物工程学院
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