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染料杂化蛋白纳米粒用于肿瘤细胞光热治疗
研究论文 | 更新时间：2021-01-26
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    • 染料杂化蛋白纳米粒用于肿瘤细胞光热治疗

    • Dye-protein Hybrid Nanoparticles for Photothermal Therapy of Tumor Cells

    • 张剑旭

      ，  

      孙婷婷

      ，  

      谢志刚

      ，  
    • 高分子学报   2019年50卷第6期 页码：633-641
    • 作者机构：

      高分子物理与化学国家重点实验室 中国科学院长春应用化学研究所　长春 130022

    • 作者简介：

      E-mail: suntt@ciac.ac.cn Ting-ting Sun, E-mail: suntt@ciac.ac.cn

      E-mail: xiez@ciac.ac.cn Zhi-gang Xie, E-mail: xiez@ciac.ac.cn

    • DOI：10.11777/j.issn1000-3304.2019.19001    

      中图分类号：

    • 纸质出版日期：2019-6，

      网络出版日期：2019-3-28，

      收稿日期：2019-1-3，

      修回日期：2019-2-12，

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  • 引用本文

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  • 张剑旭, 孙婷婷, 谢志刚. 染料杂化蛋白纳米粒用于肿瘤细胞光热治疗[J]. 高分子学报, 2019,50(6):633-641. DOI： 10.11777/j.issn1000-3304.2019.19001.

    Jian-xu Zhang, Ting-ting Sun, Zhi-gang Xie. Dye-protein Hybrid Nanoparticles for Photothermal Therapy of Tumor Cells[J]. Acta Polymerica Sinica, 2019,50(6):633-641. DOI： 10.11777/j.issn1000-3304.2019.19001.

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    摘要

    为了解决花菁类(Cypate)近红外染料作为光热试剂的一些固有缺点，例如疏水性、毒性、不稳定性等，以牛血清白蛋白和Cypate染料作为原料，在水热条件下制备出尺寸较小的稳定杂化纳米粒. 纳米结构显著改善了Cypate染料的水溶性，也提升了染料在水相溶液中的稳定性. 与小分子染料相比，染料杂化蛋白纳米粒具有良好的生物相容性和光稳定性. 此外，蛋白纳米粒具有优于小分子染料的光热转换能力，并展现了良好的光热细胞杀伤能力.

    译

    Abstract

    To make up for the inherent drawbacks (e.g. hydrophobicity, toxicity, and instability) of near-infrared Cypate dyes, as photothermal agents, stable hybrid nanoparticles (CBNPs) with small size were prepared from bovine serum albumin (BSA) and Cypate dyes under hydrothermal conditions. Free Cypate exhibited strong fluorescence whereas fluorescence quenching in CBNPs caused a sharp decrease in emission peak intensity, so the dye molecules were successfully assembled into protein nanoparticles. As-prepared CBNPs were characterized with dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy (TEM). The hydrodynamic diameter of CBNPs was around 25 – 40 nm with a low polydispersity index of 0.2, slightly higher than the measured values from TEM observation. BSA encapsulation could significantly improve the water solubility of Cypate dye and the stability of dye aqueous solutions. Besides, these nanoparticles showed good colloidal stability and biocompatibility. Photothermal experiments suggested that the protein nanoparticles had good photothermal performance and were able to generate enough heat under near-infrared laser irradiation. The photothermal conversion efficiency (η) of CBNPs under 808 nm laser irradiation reached up to 50%, which made them outperform the small molecules of neat Cypate dyes in terms of their photothermal conversion capabilities. Confocal laser scanning microscopy further revealed that the protein nanoparticles could be efficiently internalized by cancer cells in a time-dependent manner, which is very important for their therapeutic functions. Photothermal treatment toward human cervical carcinoma (HeLa) cells and human liver hepatocellular carcinoma (HepG2) cells under laser irradiation was extamined by MTT method, in which the protein nanoparticles showed an effective inhibition effect on tumor cell proliferation at the cellular level. Live/dead cell staining experiments conducted on HeLa cells also showed the same results intuitively. The dye-protein hybrid nanoparticles developed in this study as a novel nano-agent possess promising prospects in the field of tumor photothermal therapy.

    译

    图文摘要

    abstract

    Dye-protein hybrid nanoparticles with small size were successfully prepared under hydrothermal conditions. The experimental procedure was greatly simplified and the hybrid nanoparticles showed good biocompatibility and stability. Such dye-protein hybrid nanoparticles hold great potential in the application field of photothermal therapy.

    译

    关键词

    蛋白纳米粒; 花菁类染料; 超分子组装; 光热治疗

    译

    Keywords

    Protein nanoparticles; Cypate dyes; Supramolecular assembly; Photothermal therapy

    译

    光热治疗(PTT)是近几年被广泛研究的一种新兴肿瘤治疗策略. 病灶区域蓄积的光热试剂在特定波长的激光照射下，可以将吸收的光能转换为热能，从而产生局部高温，引起病灶组织细胞凋亡或坏死，而且可以有效降低对正常组织细胞的副作用[

    1, 2]. 近年来，具有光热转换能力的试剂，如硫化铜、碳纳米管、量子点、金纳米棒等纳米材料在光热治疗领域应用广泛[3~6]. 但在这些研究中，纳米药物的不可降解性、对正常组织可能引起的副作用、肿瘤部位少的蓄积量以及潜在的免疫原性都是需要解决的问题[7~9]. 近些年，在700 ~ 1000 nm波长范围内存在强吸收的有机小分子近红外染料受到了广泛关注[10]. 近红外染料在吸收特定波长的近红外光后，形成激发态，若能量通过振动弛豫或者其他的非辐射途径耗散，来自于激发态的能量将会产生热. 因此，近红外染料在近红外光照射下可以应用于肿瘤的光热治疗[11].
    译

    花菁类(Cypate)染料是被广泛研究的一种近红外染料[

    12]. 大部分Cypate染料的分子结构中存在苯环等结构导致自身强的疏水性. 此外，因自身对有机阴离子转运肽的亲和力，Cypate染料在多种肿瘤细胞中表现出潜在的集聚能力[13]. 然而，因为自身的疏水性，绝大部分Cypate染料很难溶解在水相溶液中，这严重限制了它们进一步的临床应用[14]. 此外，染料自身的毒性也是一个限制因素[12, 15]. 迄今为止，大量的研究通过将Xypate染料包封到各种纳米材料中来克服这些缺陷[12, 14]. 虽然这些策略在一定程度上提升了Cypate的水溶性，但是并没有明显提高细胞对染料的耐受剂量，而且载体制备的复杂性以及载体的生物不可降解性引起的副作用都是需要面对的问题. 因此，需要设计新的简单高效的纳米载体，不仅可以提升Cypate染料的水溶性还可以降低染料的生物毒性.
    译

    白蛋白，作为含量最高的血浆蛋白，在调节渗透压和运输内源物质上扮演着重要角色[

    16]. 许多疏水分子如脂溶性的维生素等，在血液循环中需要与白蛋白进行结合. 在过去的几十年中，白蛋白因为良好的生物相容性、不具有免疫原性、易于制备存储等优点被广泛应用于药物载体的研究[17, 18]. 多种药物可以通过共价偶联、静电相互作用或者疏水相互作用与白蛋白整合[19]. 例如，临床抗癌药紫杉醇，可以通过疏水相互作用与人血清白蛋白结合，形成白蛋白-药物纳米粒，被FDA批准用于多种肿瘤的临床治疗[20]. 虽然已有研究人员将白蛋白通过多种策略与Cypate染料整合[21]，但复杂的制备程序、较低的染料担载量以及较大的颗粒尺寸限制了这些策略的进一步应用[22, 23].
    译

    我们在先前的研究工作中发现，白蛋白与具有负电性的染料通过简单的水热法可以形成性能优良的蛋白纳米粒[

    24]. 我们使用相似的策略，尝试将带有2个羧基的Cypate染料包封到牛血清白蛋白(BSA)中形成用于肿瘤光热治疗的纳米粒(CBNPs，图1). 这种策略得到的纳米粒尺寸较小，在提升染料水溶性的同时提高了染料的光稳定性. 通过透射电镜(TEM)、动态光散射 (DLS)、粉末X射线衍射(XRD)等表征手段对纳米粒进行了分析，并对体外条件下纳米粒的光热转换能力以及肿瘤光热治疗效果进行了评价.
    译

    fig

      

    Fig 1  Scheme of the preparation of CBNPs and their application in photothermal therapy

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    1 实验部分

    1.1 主要原料

    BSA和噻唑蓝(MTT)以及青霉素-链霉素-两性霉素B混合液购自源叶生物. 所用的Cypate染料参照文献中的方法进行合成[

    22]. 二次水是从美国milli-Q公司提供的水纯化系统纯化得到. 细胞培养皿购自NEST. 多孔板皆购自于上海泰坦科技公司. 细胞培养基(DMEM)粉末购于Gibco公司. 胰蛋白酶消化液购自北京索莱宝科技有限公司. 细胞核染色剂 (DAPI) 和细胞活力(活死细胞染色试剂盒)以及细胞凋亡检测试剂盒购买自江苏凯基生物科技公司. 其他的化学品和试剂均来自于商业途径，而且没有经过进一步的纯化.
    译

    1.2 纳米粒的制备

    将BSA溶于水中，配成浓度为1 mmol/L的溶液. 将Cypate溶于乙醇中，配成浓度为1 mmol的溶液. 取5.6 mL水，置于反应釜中，分别加入0.8 mL的BSA和1.6 mL的Cypate，混合均匀后，将反应釜置于烘箱中，程序升温到100 °C，加热5 min后，取出反应釜，室温下降至可处理温度，取出釜中溶液置于透析袋中(截留分子量3500)，用去离子水透析约24 h，每3 h换1次透析液. 之后使用0.45 μm的滤头过滤.

    译

    1.3 纳米粒的理化性质表征

    纳米粒的粒径和粒径分布均由英国马尔文电位粒度仪(Zetasizer Nano ZS90)通过测定DLS得到. 测量温度选择标准室温25 °C，散射角固定在90°. TEM图由日本的JEOL JEM-1011透射电镜在加速电压100 kV时测量得到，用于观察纳米粒的形貌和尺寸分布情况. 为了制备用于测量透射电镜的样品，把10 μL的纳米粒样品滴加在碳膜覆盖的铜网上. 在空气中室温晾干. 紫外-可见光吸收光谱在Shimadzu UV-2450PC紫外-可见光扫描光谱仪上测得. 荧光发射光谱在LS-55荧光光谱仪上测得. 狭缝宽度根据需要进行调节，扫描速度是500 nm/min. 傅里叶变换红外光谱(FTIR)的测试仪器为德国Bruker Vertex 70真空傅里叶变换红外光谱仪. 样品制备的方法是将样品和溴化钾充分混合后压片. XRD广角X射线衍射仪(D8 ADVANCE 德国BRUKER公司)Cu靶波长为0.154 nm. 细胞培养箱的型号是ESCO Cell culture CO2 Incubator，Singapore. 酶标仪的型号是BioTeK ELX808TM (USA)，测定96孔细胞板在490 nm处的吸光度值. 细胞的共聚焦图片使用蔡司共聚焦激光显微镜(ZEISS LSM 700)测得.

    译

    1.4 纳米粒的光热转换能力测定

    为了评价CBNPs的光热能力，取0.3 mL CBNPs和游离的染料Cypate (5 μg/mL)使用激光(808 nm, 1 W/cm2) 照射5 min. 每隔30 s使用温度探测器测一次溶液温度. 为了计算纳米粒的光热转换效率(η)，激光照射样品2 min，当溶液温度形成平台后，撤掉激光，记录溶液回复到室温过程中的温度变化，与时间做成降温曲线. 然后参照文献的方法[

    25]，对光热转换效率进行计算. 为了更直观地监测CBNPs在水相溶液中的光热效果，溶液温度变化的照片使用红外成像仪拍摄(ThermaCAMSC3000). 研究了不同激光功率以及不同染料浓度对溶液升温的影响.
    译

    1.5 细胞实验

    1.5.1 细胞培养

    人宫颈癌细胞系(HeLa)和人肝癌细胞系(HepG2)购买自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所. 细胞使用DMEM培养基进行培养，其中添加有链霉素和青霉素以及10%的胎牛血清. 培养箱条件设定为37 °C和5%的CO2.

    译

    1.5.2 纳米粒细胞摄取测定

    纳米粒的细胞摄取使用共聚焦荧光显微镜检测. 收集对数生长期的细胞，按照每孔2.5 × 105个细胞的浓度加入到六孔板的孔中，加入细胞前，在每个孔中要先加入一个无菌处理的盖玻片. 然后在培养箱中继续培养24 h. 让细胞充分贴在盖玻片上. 然后将纳米粒溶液使用培养基稀释到所需的浓度，吸去原有的培养基，然后用纳米粒溶液对细胞进行孵育，按照设定的浓度和时间进行处理，依旧在培养箱中进行培养. 对于将要进行共聚焦的样品组，细胞使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后，使用4%的多聚甲醛对细胞进行固定10 min. 然后用PBS洗涤细胞3次. 用DAPI对细胞核进行染色，染5 min即可. 然后仍旧用PBS洗涤细胞3次. 取干净的载玻片，在片子上滴加10 μL甘油和水的等体积混合液，然后将孔板中的盖玻片取出来，注意细胞所在层面，这个层面要面对载玻片，然后放置于液体上，使用滤纸压一下，吸掉多余的液体，使用封片剂封片并做好标记. 然后将片子放在共聚焦荧光显微镜下进行观察和拍照.

    译

    1.5.3 纳米粒的生物相容性以及光毒性检测

    将处于对数生长期的细胞消化收集，离心洗涤，细胞计数，然后以每孔8000个细胞种在96孔板中，进行培养，当细胞重新贴壁并达到要求的汇合度后，先把CBNPs按照设定的浓度梯度配置好，先将原有的培养基吸走，然后将配置好的药物按顺序加好，并做好标记. 在培养箱中继续培养24 h或者48 h，然后吸去孔中的溶液，PBS洗一次，在每个孔中加入150 μL的新鲜培养基，然后每个孔中加入20 μL的MTT (5 mg/mL)，37 °C下孵育4 h. 取出孔板，吸去孔中溶液，每个孔中加入150 μL的DMSO，在酶标仪上用中等振板速度振板5 min，然后在490 nm处检测吸收值. 不加入药品的组作为对照组. 之后对细胞存活率进行计算. 细胞存活率 = 样品组的吸收值/对照组的吸收值 × 100%.

    译

    对于光热细胞毒性，肿瘤细胞与不同浓度的纳米粒孵育6 h后，吸出溶液，用PBS洗涤3次，更换为新鲜培养基，然后进行5 min激光照射 (808 nm, 1 W/cm2). 继续培养24 h后，使用MTT法评价细胞存活率.

    译

    1.5.4 活死细胞染色

    为了进一步证明纳米粒的生物相容性，将孵育过纳米粒的细胞分别使用活死细胞检测试剂盒按照说明书的操作流程进行染色. 没有使用纳米粒孵育的细胞作为对照组. 然后使用荧光显微镜观察结果并拍摄图片. 红色荧光代表死细胞，绿色荧光代表活细胞.

    译

    2 结果与讨论

    2.1 蛋白纳米粒的形成与表征

    在前期的工作中[

    24]，我们发现BSA可以与带有负电的染料在短暂加热后形成稳定的纳米粒. 本文使用相似的策略，以BSA为载体，与带有羧基的花菁类染料在水热条件下组装得到了具有光热转换能力的蛋白纳米粒(CBNPs). 首先，利用DLS对蛋白纳米粒的粒径进行了表征. 如图2(a)所示，在25 °C，CBNPs的平均粒径在25 ~ 40 nm，多分散系数为0.2，这种粒径范围有助于纳米粒在肿瘤部位集聚并进入细胞. 电位结果显示纳米粒的表面电位为负值(见电子支持信息图S1)，不会对细胞产生明显毒性. 随后，我们通过TEM对CBNPs的形貌进行了观测，TEM结果显示纳米粒呈现不规则的表面光滑的纳米结构，尺寸在30 nm左右. 由于TEM拍摄到的是样品真空处理后的干态尺寸，故TEM中粒子的尺寸相对水合粒径偏小. 这些结果显示Cypate染料与BSA蛋白形成了纳米结构.
    译

    fig

      

    Fig 2  (a) DLS intensity-weighted diameter of CBNPs (Inset: TEM image of CBNPs); (b) Absorbance spectra, (c) PL spectra, and (d) FTIR spectra of Cy, BSA and CBNPs

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    图2(b)中给出了蛋白纳米粒组装前后的紫外可见吸收光谱. 在CBNPs的光谱中同时拥有蛋白BSA的特征吸收峰和染料Cypate的特征吸收峰，表明二者已经成功组装到纳米体系中，并表明染料在纳米粒中能够维持自身的光学性质. 和游离的Cypate相比，CBNPs的吸收峰发生了红移，从785 nm 红移到797 nm，也许是因为染料与蛋白之间的相互作用以及溶剂极性的改变. 在荧光光谱中(图2(c))，游离Cypate展现了强烈的荧光，而在CBNPs中由于聚集导致荧光猝灭(ACQ)使得发射峰急剧降低，表明染料成功地组装到蛋白纳米粒中. 从BSA水溶液、Cypate的乙醇溶液和CBNPs的水溶液在白光和近红外光下的照片(见电子支持信息图S2)中可以看出，游离Cypate染料的荧光在组装成纳米粒后发生了明显的淬灭. 并且3种溶液的冻干粉也具有不同的颜色，这些结果可以从侧面证明纳米粒的成功制备.

    译

    接下来使用粉末X射线衍射和傅里叶转换红外光谱进一步研究染料和蛋白的组装. 如图2(d)所示，CBNPs的振动谱带中可以分别检测到对应小分子Cypate以及蛋白的振动谱带，并且相比于小分子和蛋白发生了偏移，显示BSA与Cypate二者之间存在强的相互作用. 此外，XRD结果(见电子支持信息图S3)显示在纳米粒中没有找到对应于染料的结晶峰，说明染料在纳米粒中呈现无定型的堆叠方式.

    译

    2.2 纳米粒水溶液的光热转换效果

    为了证明纳米粒的光热转换能力，我们监测了CBNPs水溶液在激光(808 nm, 1 W/cm2)照射下的变化并以游离小分子Cypate作为对照组. 如图3所示，激光照射下，单独的溶剂温度升高不明显，温差都在8 °C以下. 虽然游离Cypate染料升温较为明显，但光照5 min后温度仅升高不到20 °C. 而CBNPs纳米粒在光照下展现了一个快速的温度升高行为，光照下2 min就有大于30 °C的温差变化，显然，蛋白纳米粒能够快速地引起过热，足够应用于肿瘤的光热治疗. 增强的光热效率归因于染料在纳米粒中的聚集状态. 此外，较高的浓度在激光照射后能够降低热的耗散，并且激发的热辐射会被限制在纳米粒周围. 这些性质都有助于蛋白纳米粒成为强有力的光热试剂. 此外，为了更直观地观测CBNPs光照下的温度变化，使用红外热成像仪对样品组光照下的升温情况进行了观测(见电子支持信息图S4). 结果显示，随着光照时间的增加伪彩颜色逐渐加深，说明温度在逐渐升高. 这一结果和图3相一致，说明CBNPs蛋白纳米粒具有较好的光热性能，并且其光热转化的升温效果依赖于CBNPs接受激光照射的时间. 使用同样的方法进一步研究了激光功率和光热试剂浓度对纳米粒升温的影响，结果如图4所示. 5 min激光照射后，不同样品组都有一定的温度变化，并且升温效果会随着激光功率的增加而增加，并具有浓度依赖的性质. 之后对CBNPs的η值进行测定和计算，首先测定CBNPs的升降温曲线，之后降温点与时间点作图，计算得出CBNPs的η值约为50%(见电子支持信息图S5). 这些结果都表明CBNPs具有较好的光热转换能力.

    译

    fig

      

    Fig 3  Photothermal conversion behavior of CBNPs in water and Cypate in DMF under irradiation (808 nm, 1 W/cm2) for 5 min with DMF and water as the control

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    fig

      

    Fig 4  IR thermal images of the CBNPs aqueous dispersions with various power densities (upper row, with CBNPs concentration fixed at 5 μg/mL）or concentrations (lower row, with power density fixed at 1 A) under 808 nm laser irradiation for 5 min

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    2.3 纳米粒的稳定性

    良好的稳定性对于纳米粒维持它们的固有功能是非常重要的. 首先，我们利用DLS评价了CBNPs在水相溶液和含有20% FBS的溶液中的胶体稳定性. 如图5(a)和5(b)所示，CBNPs在2周内能够在水相溶液中维持它们初始的水合半径和多分散系数. 相似地，处于含有20% FBS的溶液中的CBNPs也展现了基本不变的尺寸和尺寸分布，并且外源FBS不会明显地影响纳米粒的紫外吸收光谱(见电子支持信息图S6)， 这些结果都表明蛋白纳米粒在生理条件下具有良好的胶体稳定性. 之后通过监测游离的染料和蛋白纳米粒在光照以及避光保存条件下的紫外光谱的变化研究了蛋白纳米粒的光稳定性(图5(c)和5(d)). 室温放置24 h或者6天后(见电子支持信息图S7)，游离染料的最大吸收峰发生了明显的降低，说明染料在这种条件下是不稳定的，而且在光照下，游离染料的最大吸收值下降更快，说明染料对光很敏感. 然而蛋白纳米粒的吸收峰在光照条件或者避光条件下都没有发生明显变化，显示纳米粒能够有效地提升染料的光稳定性，可能是因为蛋白能够保护染料的不饱和键免于溶液中自由基的损伤，对于进一步在生物学上的应用有利.

    译

    fig

      

    Fig 5  Stability of CBNPs in (a) water or (b) 20% FBS; UV-Vis spectra of (c) free Cypate and (d) CBNPs determined right after the dilution process or 1 day of storage (black: fresh solution; red: 1 day of storage in darkness; blue: 1 day of storage in light) (The online version is colorful.)

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    2.4 纳米粒的细胞摄取

    细胞摄取对于纳米材料执行其功能是非常必要的. 使用共聚焦显微镜对CBNPs在HeLa和HepG2细胞上的细胞摄取行为进行了研究. 细胞在37 °C用CBNPs孵育不同时间后，使用Hoechst33258对细胞核进行染色处理. 如图6所示，在细胞核周围能观测到均匀的纳米粒荧光，并且荧光强度随着纳米粒孵育时间的增加而增加. 在HepG2细胞的实验中得到了相似的结果(见电子支持信息图S8). 这些结果说明蛋白纳米粒能够被细胞摄取并在胞内发生一定程度的解离和具有时间依赖的胞内集聚行为.

    译

    fig

      

    Fig 6  Confocal microscopy images of the HeLa cells incubated with CBNPs for different time (The blue and red colors represent the fluorescence of Hoechst 33258 and CBNPs images, respectively.) (The online version is colorful.)

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    2.5 CBNPs蛋白纳米粒对肿瘤细胞的抑制性

    良好的生物相容性是光疗纳米药物必备的先决条件之一，CBNPs蛋白纳米粒的生物相容性以及在激光照射下的光毒性测试都采用MTT法. 选择了HeLa和HepG2两种细胞系进行测定. 首先，我们对BSA的细胞毒性进行了研究. 如图7(a)和7(b)所示，肿瘤细胞与不同浓度的BSA孵育24 h后，仍具有较高的细胞存活率，都维持在95%以上. 可知，BSA具有良好的生物相容性，适合作为载体构建纳米颗粒. 我们进一步采用MTT法研究了蛋白纳米粒在激光照射下对于肿瘤细胞HeLa和HepG2的光热治疗效果. 将不同浓度的CBNPs与肿瘤细胞孵育6 h后，更换为新鲜培养基，然后用808 nm的激光 (1 W/cm2) 照射5 min，继续培养24 h后检测肿瘤细胞的存活率. 如图7(c)和7(d)所示，在激光照射下，CBNPs蛋白纳米粒则表现出较大的细胞毒性，且随着CBNPs浓度的增加，细胞存活率逐渐降低；当CBNPs的量达到最高值后，CBNPs中细胞存活率不到20%. 而不加光照的对照组没有产生明显的细胞死亡. 这些结果说明，CBNPs自身具有良好的生物相容性，而在激光照射下具有较好的光热转换效果，能有效抑制肿瘤细胞的增殖，说明该蛋白纳米粒有望用于恶性肿瘤的光热治疗.

    译

    fig

      

    Fig 7  The cell viability of (a) HeLa or (b) HepG2 cells incubated with BSA at different concentrations; The cell viability of (c) HeLa or (d) HepG2 cells incubated with CBNPs without and with irradiation by 808 nm laser (1 W/cm2, 5 min)

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    2.6 活死细胞染色

    为了更直观地显示CBNPs在肿瘤细胞光热消除上的效果，肿瘤细胞分别使用PBS和CBNPs处理后，用激光照射5 min. 使用活死细胞染色试剂盒对光照后的细胞进行处理，钙黄绿素染活细胞，PI染死细胞. 图8显示只有激光照射不会明显的影响HeLa细胞的活力，在对照组以及仅有蛋白纳米粒孵育的样品组中，没有发现死细胞，都是活细胞，这与MTT实验结果相符合. CBNPs孵育的样品组在光照下产生了大量的PI信号，表明死细胞的出现，说明细胞发生了明显的死亡. HepG2细胞给出了相似的结果(见电子支持信息图S9). 这些结果都显示CBNPs在激光照射下具有强大的杀伤肿瘤细胞的能力，进一步说明CBNPs具有很大的希望成为应用于肿瘤治疗的光热体系.

    译

    fig

      

    Fig 8  Fluorescence microscopy images of HeLa cells co-cultured with calcein AM (green, dye of live cells) and propidium iodide (red, dye of dead cells), in the absence (upper row) or presence (lower row) of CBNPs, and subjected to irradiation (right column) or not (left column) (The online version is colorful.)

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    3 结论

    本文设计并制备得到一种平均尺寸较小的包封有花菁类染料的蛋白纳米粒，纳米粒具有较好的胶体稳定性和生物相容性，使用BSA包封不仅提升了Cypate染料的水溶性也提升了染料在水相溶液中的稳定性. 光热实验结果表明，蛋白纳米粒具有良好的光热性能，能够在近红外光照射下快速产生足够的热量，展现了良好的光热转换能力. 此外，蛋白纳米粒能够有效地被细胞摄取. 重要的是，在细胞水平上，蛋白纳米粒在激光照射下能够很好地抑制肿瘤细胞的增殖活性. 总之，这种新型的染料-蛋白杂化纳米粒作为肿瘤光热治疗的纳米试剂在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景.

    译

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