一步酸化法制备抗菌肽胶束及其抗菌性能研究

江金辉; 杨雨嬴; 凡刘杰; 朱云卿; 杜建忠

doi:10.11777/j.issn1000-3304.2021.21135

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一步酸化法制备抗菌肽胶束及其抗菌性能研究

研究论文 | 更新时间：2023-05-22

- 一步酸化法制备抗菌肽胶束及其抗菌性能研究
  增强出版
- Antibacterial Micelles Self-assembled from Copolypeptides through a One-step Acidification Process
- 角色： First author , 第一作者 ,
  
  机构：
  同济大学附属第十人民医院骨科上海 200072
  同济大学材料科学与工程学院高分子材料系上海 201804
  
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  江金辉
  ，
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  机构：
  同济大学附属第十人民医院骨科上海 200072
  
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  杨雨嬴
  ，
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  机构：
  同济大学附属第十人民医院骨科上海 200072
  
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  凡刘杰
  ，
  角色： Corresponding author , 通讯作者 ,
  
  机构：
  同济大学附属第十人民医院骨科上海 200072
  同济大学材料科学与工程学院高分子材料系上海 201804
  
  邮箱： 1019zhuyq@tongji.edu.cn
  
  简介： E-mail: 1019zhuyq@tongji.edu.cn
  
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  朱云卿
  ，
  角色： Corresponding author , 通讯作者 ,
  
  机构：
  同济大学附属第十人民医院骨科上海 200072
  同济大学材料科学与工程学院高分子材料系上海 201804
  
  邮箱： jzdu@tongji.edu.cn
  
  简介： jzdu@tongji.edu.cn
  
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  杜建忠
  ，
- 高分子学报 2021年52卷第12期页码：1559-1567
- 作者机构：
  
  1.同济大学附属第十人民医院骨科上海 200072
  2.同济大学材料科学与工程学院高分子材料系上海 201804
- 作者简介：
  
  E-mail: 1019zhuyq@tongji.edu.cn
  jzdu@tongji.edu.cn
- 基金信息：
  
  国家杰出青年科学基金(基金号 21925505);国家自然科学基金(基金号 51903190);上海市科委国际合作项目(21520710100);上海市浦江人才计划(19PJ1409600)
- DOI：10.11777/j.issn1000-3304.2021.21135
  中图分类号：
- 纸质出版日期：2021-12-20，
  
  网络出版日期：2021-09-02，
  
  收稿日期：2021-05-11，
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江金辉,杨雨嬴,凡刘杰等.一步酸化法制备抗菌肽胶束及其抗菌性能研究[J].高分子学报,2021,52(12):1559-1567.

Jiang Jin-hui,Yang Yu-ying,Fan Liu-jie,et al.Antibacterial Micelles Self-assembled from Copolypeptides through a One-step Acidification Process[J].ACTA POLYMERICA SINICA,2021,52(12):1559-1567.
江金辉,杨雨嬴,凡刘杰等.一步酸化法制备抗菌肽胶束及其抗菌性能研究[J].高分子学报,2021,52(12):1559-1567. DOI： 10.11777/j.issn1000-3304.2021.21135.

Jiang Jin-hui,Yang Yu-ying,Fan Liu-jie,et al.Antibacterial Micelles Self-assembled from Copolypeptides through a One-step Acidification Process[J].ACTA POLYMERICA SINICA,2021,52(12):1559-1567. DOI： 10.11777/j.issn1000-3304.2021.21135.

一步酸化法制备抗菌肽胶束及其抗菌性能研究增强出版

江金辉 ; 杨雨嬴 ; 凡刘杰 ; 朱云卿 ; 杜建忠 ;

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摘要

提出了简化抗菌肽纳米粒子制备流程的“一步酸化法”. 利用[1-(4-氨基苯基)-1,2,2-三苯基]乙烯(TPE-NH₂)引发N_ε-三氟乙酰基-l-赖氨酸环内酸酐[Lys(Tfa) NCA]和l-谷氨酸-γ-苄酯环内酸酐(BLG NCA)单体的开环共聚，然后选择性脱除三氟乙酰保护基，制备了无规共聚多肽TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆). 随后，采取一步酸化法直接制备了共聚多肽胶束溶液. 抗菌实验结果表明，该抗菌肽胶束对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为256和64 μg/mL，最低杀菌浓度分别为400和100 μg/mL. 此外，由于其四苯乙烯(TPE)端基具有聚集诱导发光效应，该抗菌肽胶束还有望用于可视化探究抗菌机理.

译

Abstract

We propose a one-step acidification method for facile preparation of antibacterial micelles. The random copolypeptide TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆) was obtained by selective deprotection of the trifluoroacetyl groups from a TPE-P[Lys(Tfa)₂₈-stat-BLG₁₆] precursor. This initial random copolypeptide was synthesized by ring-opening copolymerization of N_ε-trifluoroacetyl-l-lysine N-carboxyanhydride [Lys(Tfa) NCA] and γ-benzyl-l-glutamate N-carboxyanhydride (BLG NCA) using 4-‍(1,2,2-triphenylvinyl)aniline (TPE-NH₂) as initiator. After polymerization and deprotection, polymer micelles were formed by acidification of the crude aqueous TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆) reaction mixture. Thus, this method is called a "one-step acidification process". The obtained micelles should have good antibacterial properties, given that this random copolypeptide comprises a large number of aromatic and amino groups. The antibacterial properties of these micelles were evaluated using the broth microdilution method and the plate paint method, to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC). These tests showed that these polymer micelles have indeed antibacterial properties: the determined MICs for E. coli and S. aureus were 256 and 64 μg/mL; the determined MBCs for these bacteria were 400 and 100 μg/mL, respectively. Interestingly, these antibacterial micelles produce bright blue fluorescence light under UV exposure, owing to the aggregation-induced emission (AIE) effect of the TPE end groups. Herein, this property was used to optically explore the antibacterial mechanism of these polymer micelles. This approach indicated that these polymer micelles kill bacteria by piercing their membrane via a physically damaging process.

译

图文摘要

We proposed a one-step acidification method for preparing antibacterial micelles in a simple manner. The micelles displayed good antibacterial properties. This simple method holds potential in preparation of polypeptide-based antibacterial micelles.

译

关键词

聚多肽; 一步酸化法; 胶束; 自组装; 抗菌

译

Keywords

Polypeptides; One-step acidification; Micelles; Self-assembly; Antibacterial

译

本文附有电子支持材料，与正文一并刊载在本刊网站http://www.gfzxb.org

译

细菌感染是一个普遍存在的问题，目前最常用的应对策略是抗生素治疗. 但是，全世界每年约有50%的抗生素被滥用，导致细菌的耐药性逐渐增强，并出现了“超级细菌”^[

1~4]. 因此，寻找或设计不会使细菌产生耐药性的抗菌材料具有重要意义^{[参考文献 4~9

4~9]}. 研究发现，一些天然多肽对细菌具有广谱、高效杀菌活性. 由于其抗菌机理源于对细菌膜的破坏，因而大大降低了细菌耐药的可能性^{[参考文献 10~12

10~12]}. 然而，天然抗菌肽通常来源于动植物体内，面临着产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵等一系列问题，限制了其实际应用. 最近，人们发现纳米粒子可以通过破坏细菌膜的方式杀死细菌，不易使细菌产生耐药性^{[参考文献 13~19

13~19]}. 随着多肽合成方法的发展，尤其是氨基酸环内酸酐(NCA)开环聚合技术的出现，使得抗菌肽的低成本制备成为可能^{[参考文献 5

百度学术

5,参考文献 20~25

20~25]}. 同时，通过大分子自组装可以制备不同的纳米粒子^{[参考文献 26~30

26~30]}. 若以抗菌肽为组装基元，还可制备一系列生物医用纳米粒子^{[参考文献 5

百度学术

5,参考文献 20

百度学术

20,参考文献 31~33

31~33]}. 譬如，抗菌肽囊泡不仅具有优异的抗菌性能，而且可以递送多种药物. 与抗菌肽本身相比，抗菌肽囊泡可以大幅提升抗菌性和选择性，降低其细胞毒性^{[参考文献 34~37

34~37]}. 然而，目前抗菌肽纳米粒子的制备方法大多基于传统的溶剂交换法，过程较为繁琐. 因此，如何简化抗菌肽纳米粒子的制备流程是一个值得研究的重要问题.

译

基于上述问题，我们通过简便的一步酸化法，实现了抗菌肽胶束的高效制备(图1). 如图2所示，通过TPE-NH₂引发Lys(Tfa) NCA和BLG NCA 2种NCA单体的开环无规共聚，并经过脱除三氟乙酰基保护，制备了聚赖氨酸-无规-聚谷氨酸苄酯[TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆)]. 在脱保护后的粗产物中加入少量盐酸溶液便可直接组装，透析后即可获得较高浓度的抗菌肽胶束溶液(图1). 抗菌实验结果表明，该无规共聚抗菌肽胶束对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均有良好的抗菌效果.

译

Fig. 1 One-step acidification method for preparing polypeptide-based antibacterial micelles.

下载: 原图 | 高精图 | 低精图

Fig. 2 Synthetic route of TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆) copolypeptides.

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1 实验部分

1.1 主要原料

二苯甲酮、4-氨基二苯甲酮、四氯化钛、锌粉、L-谷氨酸-γ-苄酯、N_ε-三氟乙酰基-L-赖氨酸、三光气、α-蒎烯、氯化钠、碳酸氢钠、无水硫酸镁、无水碳酸钾、柱层析硅胶等试剂购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，未经进一步纯化. 乙酸乙酯、正己烷、无水N,N-二甲基甲酰胺、乙醚、浓盐酸、无水甲醇等溶剂购于国药集团化学试剂有限公司，其中四氢呋喃通过加钠重蒸除水. DMSO-d₆、CDCl₃等氘代试剂购于Sigma Aldrich. LB肉汤、LB琼脂购于青岛海博生物技术有限公司. 大肠杆菌(E. coli，ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(S. aureus，ATCC29213) 购于北纳生物科技有限公司.

译

1.2 测试与表征

1.2.1 核磁共振氢谱分析(¹H-NMR)

采用德国Bruker公司生产的AV 400 MHz系列核磁共振仪，分析单体及聚合物的共振氢谱组成, 溶剂为DMSO-d₆和CDCl₃，采用四甲基硅烷作为内标.

译

1.2.2 动态激光光散射(DLS)

采用德国Malvern公司生产的ZETASIZER Nano series动态激光光散射仪(Malvern Instruments ZS 90)，测量抗菌肽纳米粒子的流体力学直径和多分散系数. 测试温度为25 ℃，散射角度为90°，所有测试重复3次.

译

1.2.3 透射电子显微镜(TEM)

采用日本JEOL公司生产的JEM-2100F系列透射电子显微镜，分析抗菌肽纳米粒子的形貌. TEM配备Gatan 894 Ultrascan 1k CCD相机，在200 kV加速电压下观察和拍照. 样品制备：取10.0 μL一定浓度的组装液滴于铜网上并自然晾干.

译

1.2.4 荧光分光光度计

采用Thermo Fisher公司生产的荧光分度计，用于组装体荧光的测定，激发波长为330 nm，发射波长为470 nm.

译

1.2.5 激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)

采用尼康C2 Plus激光共聚焦扫描显微镜探究抗菌肽胶束的可视化抗菌过程，其中红色荧光的发射波长为561 nm，蓝色荧光的发射波长为470 nm.

译

1.3 无规共聚多肽TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆)的合成

1.3.1 [1-(4-氨基苯基)-1,2,2-三苯基]乙烯(TPE-NH₂)的合成

将二苯甲酮(3.64 g，20.0 mmol)，4-氨基二苯甲酮(3.95 g，20.0 mmol)，锌粉(11.5 g，176 mmol)和150 mL无水THF加入250 mL双口烧瓶中并搅拌，通入氩气除氧15 min. 之后，将烧瓶置于低温反应槽中并冷却至-40 ℃，逐滴滴入TiCl₄(4.80 mL，44.0 mmol)，30 min左右滴完，然后于室温下搅拌30 min，最后置于80 ℃下回流反应48 h. 反应结束之后，用200 mL 1 mol/L的盐酸溶液淬灭反应，然后用100 mL乙酸乙酯萃取. 有机层分别用饱和碳酸氢钠溶液(100 mL×3)、饱和氯化钠溶液(100 mL×3)洗涤，之后用无水MgSO₄干燥，过滤，旋干得到的粗产品用柱层析法进一步提纯，洗脱剂为正己烷/乙酸乙酯(4/1，V/V)，得到橙黄色固体3.91 g，产率约为51%.

译

1.3.2 L-谷氨酸-γ-苄酯环内酸酐(BLG NCA)的合成

将L-谷氨酸-γ-苄酯(5.00 g，21.1 mmol)，α-蒎烯(9.19 g，67.5 mmol)和120 mL THF加入250 mL双口烧瓶中并搅拌，然后将三光气(5.00 g，16.9 mmol)溶于30.0 mL的四氢呋喃并通过恒压漏斗逐滴滴入烧瓶中，之后置于55 ℃条件下反应. 大约2 h后，溶液变澄清透明，继续反应1 h，停止反应. 将反应液浓缩至30.0 mL左右并倒入400 mL正己烷中，有白色絮状沉淀析出，随后将烧杯于-20 ℃条件下放置过夜，抽滤，真空烘干后得到白色固体3.90 g，产率约为70%.

译

1.3.3 N_ε-三氟乙酰基-L-赖氨酸环内酸酐(Lys(Tfa) NCA)的合成

将N_ε-三氟乙酰基-L-赖氨酸(5.00 g，20.6 mmol)，α-蒎烯(9.00 g，66.1 mmol)和120 mL THF加入250 mL双口烧瓶中并搅拌，然后将三光气(4.90 g，16.5 mmol)溶于30.0 mL的四氢呋喃并通过恒压漏斗逐滴滴入烧瓶中，之后置于55 ℃条件下反应. 大约3 h后，溶液变澄清透明，继续反应1 h，停止反应.将反应液过滤并浓缩至30.0 mL左右并倒入400 mL正己烷中，有白色絮状沉淀析出，随后将烧杯于-20 ℃条件下放置过夜，抽滤，真空烘干后得到白色固体3.23 g，产率约为58%.

译

1.3.4 无规共聚多肽TPE-P[Lys(Tfa)₂₈-stat-BLG₁₆]的合成

将TPE-NH₂ (0.0500 g，0.144 mmol)、Lys(Tfa) NCA (2.32 g，8.63 mmol)和BLG NCA (1.14 g，4.32 mmol)溶于10.0 mL无水DMF中，置于30 ℃抽气反应48 h. 反应后的溶液于250 mL乙醚中沉淀，然后离心，重复3次之后将所得固体置于真空干燥箱中干燥24 h后得到米黄色产物. 其他2种无规共聚多肽TPE-P[Lys(Tfa)₇-stat-BLG₅₀]和TPE-P[Lys(Tfa)₄₇-stat-BLG₅]采用相似的方法合成.

译

1.3.5 无规共聚多肽TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆)的合成

将0.500 g无规共聚多肽TPE-P[Lys(Tfa)₂₈-stat-BLG₁₆]分散于18.9 mL甲醇/水混合溶剂中(甲醇与水的体积比为20∶1)，然后加入1.50 g无水碳酸钾，置于25 ℃反应5 h. 反应后的溶液旋干即得到粗制的无规共聚多肽TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆). 其他2种粗制的无规共聚多肽TPE-P(Lys₇-stat-BLG₅₀)和TPE-P(Lys₄₇-stat-BLG₅)采用相似的方法合成.

译

1.4 一步酸化法制备胶束

向上述脱保护的粗产品TPE-P(Lys₂₈-stat- BLG₁₆)中加入浓度为5.0 mol/L的盐酸溶液5.0 mL, 之后小幅度手动摇匀15 s左右，然后静置5 min即可得到淡蓝色溶液，随后将该淡蓝色溶液装入截留分子量为8000~14000的透析袋中,用去离子水透析3天，每4 h换1次水，除去溶解的无机盐及少量的甲醇后即可得到相应的组装体溶液.

译

1.5 肉汤稀释法测定胶束的最小抑菌浓度

最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)是指完全抑制细菌生长的最低药物浓度，是表征抗菌药物抗菌活性大小的一个重要指标^[

35]. 我们分别测试了上述制备的无规共聚多肽TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆)组装体对革兰氏阴性菌(大肠杆菌, E. coli, ATCC25922)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌, S. aureus, ATCC29213)的抗菌效果，首先利用肉汤稀释法粗略测定其MIC值，具体操作过程如下：

译

(1) LB肉汤培养基配置. LB肉汤固体(12.5 g)溶于500 mL去离子水中，120 ℃灭菌30 min，待用.

译

(2) 细菌活化. 取2支灭过菌的离心管加入10.0 mL LB肉汤，分别从大肠杆菌、金黄色葡萄球菌母液涂板的琼脂中挑去一个菌落放入其中，置于37 ℃培养箱活化8 h.

译

(3) 组装体溶液的稀释. 在96孔板的相应孔中分别加入100 μL LB肉汤.在第一孔中加入100 μL较高浓度的组装体溶液，混合均匀后取100 μL加入到第二个孔中，混合均匀后再取100 μL加入到第三个孔中，以此类推，最后一个孔不加作为对照组.通过此对半稀释的方式得到不同浓度的聚合物溶液(浓度范围从2000~64 μg/mL).

译

(4) 组装体溶液与细菌悬液混合. 取10.0 μL活化好的大肠杆菌(或金黄色葡萄球菌)菌液，加入到含有10.0 mL LB肉汤的培养皿中，轻微晃动培养皿，使其混合均匀. 此时，菌液浓度约为10⁵ CFU/mL. 取稀释后的细菌液100 μL，分别加到步骤3中各个不同浓度的孔中. 加入菌液后各个孔样品浓度再被稀释一半，最终得到与菌液作用的聚合物浓度范围为1000~32 μg/mL.

译

(5) 将96孔板置于37 ℃恒温摇床培养，摇速为150 r/min，24 h后观察细菌生长情况. 每组样品进行3次平行实验.

译

注：所有使用的容器与耗材(无菌耗材除外)均于120 ℃灭菌30 min后使用.

译

1.6 动态抗菌法表征胶束的抗菌性能

动态抗菌法是利用分光光度计测定细菌液的吸光度(OD值)，通过细菌液的浓度与其浑浊度的正比关系，细菌液浓度越低，其吸光度也越低^[

35]. 动态抗菌法能够及时记录细菌生长情况，从而观测整个抑菌的动态过程. 具体操作如下：

译

(1) 聚合物稀释及其与细菌悬液混合的方法同肉汤稀释法.

译

(2) 通过酶标仪实质为分光光度计测定96孔板中细菌液在600 nm处的吸光度值减去纯LB肉汤在600 nm处的吸光度. 每隔2 h测量1次.

译

1.7 平板菌落计数法测定胶束的最小杀菌浓度

最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)是指能够完全杀灭细菌的最小抗菌剂浓度，与最小抑菌浓度的概念有所区别，也是衡量抗菌剂抗菌性能的一个重要指标^[

35].

译

平板菌落计数法是将与抗菌剂作用过的细菌液稀释适当倍数后，取一定量稀释的样品混匀在固体培养基中. 经过培养，细菌形成清晰可见的菌落，一个菌落对应样品中一个细菌. 根据菌落个数及稀释倍数，可以计算出待测样品内活的细菌数量. 通过对照组与实验组的对比，表征样品的抗菌性能. 其具体过程如下：

译

(1) 在肉汤稀释法的基础上，将24 h后96孔板中清澈的孔作为实验组，从中各取出10.0 μL细菌液，于PBS中稀释100倍. 再从对照组孔中取出10.0 μL细菌液，同样于PBS中稀释100倍，作为平板菌落计数法中的对照组.

译

(2) 待LB琼脂固体培养基冷却至约45 ℃，向培养皿中加入10.0 mL LB琼脂培养基中，并向其中加入100 μL上述细菌液，轻轻晃动培养皿，使其混合均匀后，静置. 待培养基完全凝固，将培养皿倒扣，在37 ℃下静置培养48 h.

译

(3) 48 h后，观察培养皿中菌落生长情况，没有肉眼可见菌落即代表该浓度下聚合物能够完全杀死细菌，取最小的符合上述现象的聚合物浓度作为最小杀菌浓度(MBC).

译

1.8 可视化抗菌过程探究

通过荧光共聚焦扫描显微镜观察抗菌肽胶束对大肠杆菌细菌膜的破坏作用. 具体操作如下：

译

(1) 向1.00 mL浓度为2.0 mg/mL的抗菌肽胶束溶液中加入200 μL浓度约为10⁹ CFU/mL的大肠杆菌悬液，置于37 ℃恒温摇床培养4 h.

译

(2) 将上述悬液以6000 r/min的转速离心15 min，倒掉上层清液，然后重新分散在1.00 mL的PBS中.

译

(3) 向上述重新分散的悬液中加入1.0 μL浓度为2.0 mg/mL的尼罗红的丙酮溶液，染色15 min.

译

(4) 取1.0 μL的上述悬液滴加在灭过菌的载玻片上并盖上盖玻片，之后用适量指甲油进行封片置于激光共聚焦扫描显微镜下拍摄.

译

2 结果与讨论

2.1 无规共聚多肽TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆)的合成与表征

小分子引发剂TPE-NH₂、Lys(Tfa) NCA单体、BLG NCA单体的合成路线及核磁共振氢谱图见电子支持信息图S1~S4. 无规共聚多肽TPE-P[Lys(Tfa)₂₈-stat-BLG₁₆]、TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆)、P[Lys(Tfa)₇-stat-BLG₅₀]、P(Lys₇-stat-BLG₅₀)、P[Lys(Tfa)₄₇-stat-BLG₅]以及P(Lys₄₇-stat-BLG₅)的核磁共振氢谱图及相应聚合度的计算见电子支持信息图S5~S10. 在TPE-P[Lys(Tfa)₂₈-stat-BLG₁₆]脱保护后，通过分析其透析冻干物的核磁图谱可知，电子支持信息图S6中j峰化学位移相较于未脱保护时(电子支持信息图S5)明显向高场移动，表明与三氟乙酰基相邻的亚甲基吸电子效应减弱，聚合物中的三氟乙酰基团的成功离去，即成功合成了无规共聚多肽TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆).

译

2.2 一步酸化法自组装形成胶束

通过向无规共聚多肽TPE-P[Lys(Tfa)₂₈-stat-BLG₁₆]脱保护所得的粗产物TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆)中直接加入适量的盐酸溶液，然后透析即可得到相应组装体. 通过取样冻干分析，最终所得无规共聚多肽纳米粒子的浓度为8.0 mg/mL. 利用透射电镜对该胶束的形貌进行观测，如图3所示，从TEM图中可以明显看到大小比较均匀的胶束(图3(a))，并且根据TEM结果进行统计分析可知，胶束的直径约为(72±17) nm (图3(b)). DLS测试结果(图3(c))显示纳米粒子的平均粒径约为100 nm，这是由于胶束在溶液中发生溶胀的结果^[

38]. TEM与DLS的结果表明利用一步酸化法成功制备了多肽胶束.

译

Fig. 3 One-step acidification method for preparing antibacterial micelle. (a) TEM image, (b) size distribution of the micelles, (c) DLS result and (d) fluorescence spectrum and the digital photo of the micelle dispersion under UV exposure. The excitation wavelengths of UV are 330 and 350 nm for fluorescence tests and the photo shoot, respectively.

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由于无规共聚多肽中赖氨酸组分与谷氨酸苄酯组分在一步酸化法制备多肽胶束的过程中分别充当了亲水与疏水成分，因此聚合物中赖氨酸与谷氨酸苄酯的比例也会影响该一步酸化法的结果. 在无规共聚多肽TPE-P(Lys₇-stat-BLG₅₀)中，由于谷氨酸苄酯含量过高，聚合物的疏水性很强，因此利用一步酸化法只能形成悬浊液(电子支持信息图S11(a))；而在无规共聚多肽TPE-P(Lys₄₇-stat-BLG₅)中，由于赖氨酸含量过高，聚合物的亲水性很强，采用一步酸化法后发现聚合物基本溶解，并未发现组装现象(电子支持信息图S11(c)). 因此，只有当无规共聚多肽中赖氨酸组分与谷氨酸组分处于一个比较恰当的比例时才能采用一步酸化法形成多肽胶束(电子支持信息图S11(b)). 此外，四苯乙烯(TPE)基团具有聚集诱导发光(AIE)效应^[

39]，因此该胶束溶液在470 nm附近具有肉眼可见的蓝色荧光(图3(d))，这有利于后续的可视化抗菌研究.

译

2.3 胶束的最小抑菌浓度(MIC)

通过96孔板肉汤稀释法可以测得TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆)胶束的最小抑菌浓度. 24 h后，通过肉眼观察培养96孔板小孔中菌液的浑浊情况，将浑浊到清澈转变的第一个清澈的小孔内聚合物的浓度作为最小抑菌浓度即MIC值. 其中“+”表示培养基澄清，即有抑菌效果；“-”表示培养基浑浊，即没有抑菌效果. 该胶束对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC值分别为64和256 μg/mL(表1)，同大多数报道的无规共聚多肽

译

Table 1 Minimum inhibitory concentration (MIC) of micelles.

Concentration (μg/mL)	S. aureus	E. coli
1000	+	+
800	+	+
640	+	+
512	+	+
256	+	+
128	+	-
64	+	-
32	-	-
0	-	-

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纳米粒子的抗菌性能相近^[

5,35,40]，表明其对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有良好的抗菌性能. 尽管同商业化的抗菌剂(如抗生素左氧氟沙星)的抗菌性能相比仍有较大差距(电子支持信息表S1)，但是该抗菌肽胶束的抗菌机理为物理性的膜破坏机理^{[参考文献 40

百度学术

40]}，不易使细菌产生耐药性. 由于该抗菌肽胶束在470 nm处有蓝色荧光，因此利用荧光共聚焦扫描显微镜对其膜破坏机理进行了进一步的验证. 为了能清晰地观察到细菌膜结构，选用尼罗红作为细菌膜的染色剂^{[参考文献 41

百度学术

41]}. 在没有抗菌肽胶束存在的情况下，可以观察到完整的细菌膜结构(电子支持信息图S12(a))；而当抗菌肽胶束溶液同细菌作用4 h后，可以同时观察到红色荧光与蓝色荧光(电子支持信息图S12(b))，表明该抗菌肽胶束确实能够吸附在细菌表面. 这是由于赖氨酸的氨基在水溶液中质子化而带有正电荷，而细菌表面带有负电荷，因此通过静电吸附作用，抗菌胶束可以吸附在细菌表面. 同时，细菌膜上原来连续性的红色荧光出现了部分聚集，表明抗菌肽胶束确实对细菌膜具有破坏作用. 这是因为抗菌链段中的谷氨酸苄酯疏水段则能够刺破细菌的细胞膜，使细菌内容物外流，导致细菌死亡^{[参考文献 40

百度学术

40]}.

译

同时，通过动态抗菌法观测胶束的动态抗菌过程，如图4所示. MIC数据表明(表1)，胶束对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为64和256 μg/mL. 从图4(a)和4(b)中可以看出，低于该浓度的组分别在培养6 h后，细菌数量明显增长. 而MIC及其以上浓度的组别，细菌液的OD值一直远远低于对照组，且24 h后仍然保持在较低的OD值，证明了该浓度下胶束能持续抑制细菌生长. 图4(c)与图4(d)是抗菌多肽胶束在不同时刻下，各浓度样品动态抗菌的吸光度值，可以更直观地表明，随着浓度的升高，吸光度减小，细菌生长受到抑制.

译

Fig. 4 (a, b) Dose-dependent growth inhibition of bacteria in the presence of micelles; (c, d) Absorbance of different micelle concentrations at 0, 8 and 24 h. OD: optical density.

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2.4 胶束的最小杀菌浓度(MBC)

肉汤稀释法中澄清的孔并不代表没有细菌存在，要确定在该浓度下聚合物是否杀死了所有的细菌，需要采用平板菌落计数法对活细菌的数量进行计数，从而测定其最小杀菌浓度(MBC). 48 h后，将没有观察到有细菌菌落生长的对应的最低样品浓度作为最小杀菌浓度. TPE-P(Lys₂₈-stat-BLG₁₆)胶束对金黄色葡萄球菌及的大肠杆菌涂板结果如图5所示.在64和256 μg/mL时，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌仍有少量菌落存在，而提高浓度至100 μg/mL以及400 μg/mL时，培养皿中没有肉眼可见菌落. 因此该抗菌多肽胶束对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MBC值分别为100和400 μg/mL.

译

Fig. 5 Antibacterial results against S. aureus and E. coli by plate paint method.

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3 结论

本文报道了一种一步酸化法直接制备无规共聚多肽胶束的方法. 抗菌实验结果表明，该抗菌肽胶束对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为256和64 μg/mL，最低杀菌浓度分别为400和100 μg/mL，表现出良好的抗菌性. 此外，该抗菌肽胶束能够完全生物降解，有望作为绿色环保型抗菌喷剂应用于日常生活中物体表面的杀菌.

译

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摘要

提出了简化抗菌肽纳米粒子制备流程的“一步酸化法”. 利用[1-(4-氨基苯基)-1

2-三苯基]乙烯(TPE-NH

)引发

-三氟乙酰基-l-赖氨酸环内酸酐[Lys(Tfa) NCA]和l-谷氨酸-

-苄酯环内酸酐(BLG NCA)单体的开环共聚，然后选择性脱除三氟乙酰保护基，制备了无规共聚多肽TPE-P(Lys

stat

-BLG

). 随后，采取一步酸化法直接制备了共聚多肽胶束溶液. 抗菌实验结果表明，该抗菌肽胶束对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为256和64 μg/mL，最低杀菌浓度分别为400和100 μg/mL. 此外，由于其四苯乙烯(TPE)端基具有聚集诱导发光效应，该抗菌肽胶束还有望用于可视化探究抗菌机理.

Abstract

We propose a one-step acidification method for facile preparation of antibacterial micelles. The random copolypeptide TPE-P(Lys

stat

-BLG

) was obtained by selective deprotection of the trifluoroacetyl groups from a TPE-P[Lys(Tfa)

stat

-BLG

] precursor. This initial random copolypeptide was synthesized by ring-opening copolymerization of

-trifluoroacetyl-l-lysine

-carboxyanhydride [Lys(Tfa) NCA] and

-benzyl-l-glutamate

-carboxyanhydride (BLG NCA) using 4-‍(1

2-triphenylvinyl)aniline (TPE-NH

) as initiator. After polymerization and deprotection

polymer micelles were formed by acidification of the crude aqueous TPE-P(Lys

stat

-BLG

) reaction mixture. Thus

this method is called a "one-step acidification process". The obtained micelles should have good antibacterial properties

given that this random copolypeptide comprises a large number of aromatic and amino groups. The antibacterial properties of these micelles were evaluated using the broth microdilution method and the plate paint method

to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC). These tests showed that these polymer micelles have indeed antibacterial properties: the determined MICs for

coli

and

aureus

were 256 and 64 μg/mL; the determined MBCs for these bacteria were 400 and 100 μg/mL

respectively. Interestingly

these antibacterial micelles produce bright blue fluorescence light under UV exposure

owing to the aggregation-induced emission (AIE) effect of the TPE end groups. Herein

this property was used to optically explore the antibacterial mechanism of these polymer micelles. This approach indicated that these polymer micelles kill bacteria by piercing their membrane

via

a physically damaging process.

关键词

聚多肽一步酸化法胶束自组装抗菌

Keywords

PolypeptidesOne-step acidificationMicellesSelf-assemblyAntibacterial

references

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